一种软骨细胞无血清培养基及其制备方法技术

本发明专利技术涉及体外组织细胞分离技术领域，具体涉及一种软骨细胞无血清培养基，由基础培养基、血清替代物以及生长因子组成，不仅解决了现有技术中的血清培养基带来的问题，而且软骨细胞生长过程中很好的贴壁并增值速度更快，有利于获得更多细胞量，同时在软骨细胞增殖的同时能够保持软骨细胞的特性，未出现明显的去分化现象。

Cartilage cell serum-free culture medium and preparation method thereof

The present invention relates to the technical field of in vitro tissue cells, in particular to a cartilage cell in serum-free medium is composed of basic culture medium, serum replacement and growth factor, not only solve the problem of training base to bring the serum in the prior art, and cartilage cells adherent students good long process and value-added faster and help to get more cells, while maintaining the characteristics of chondrocytes in cartilage cell proliferation at the same time, there is no obvious differentiation phenomenon.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医学材料
，具体涉及一种软骨细胞无血清培养基及其制备方法。
技术介绍
软骨是由软骨细胞和细胞外基质组成的无血管组织，软骨细胞是关节软骨中唯一的细胞类型，其主要功能是通过分泌II型胶原(type II collagen)及蛋白多糖(aggrecan，Acan)等保持关节软骨的功能。在正常生理条件下，软骨细胞的合成和分解代谢维持着动态平衡；而软骨细胞主要依靠关节的运动和挤压吸收营养物质，所以软骨损伤后自我修复能力比较弱，其损伤后的修复一直以来都是医学界的难题之一。经过十多年的临床应用及技术发展，字体软骨细胞移植技术已成为临床治疗软骨损伤最有效的方法。大多数动物细胞都不同程度地依赖血清才能在体外生长增殖。常规的软骨细胞培养是在含有10％的血清的DMEM培养基条件下进行的。血清可以提供细胞生长所需的营养物质，同时血清中含有各类生长因子，可促进细胞的增殖。但血清成分复杂，在对细胞产物进行分析或者提纯时会受到血清成分的干扰，而且不同批次血清的质量难以保持一致，另外，血清中还含有一定量的细胞毒性物质和抑制物质，对细胞有去分化作用，影响某些细胞功能的表达。在有血清的培养条件下，随着传代次数增加，软骨细胞很容易去分化生成纤维细胞状态，无法分泌软骨细胞分泌的软骨特异性Ⅱ型胶原蛋白及蛋白聚糖，失去正常软骨细胞表型。而无血清培养基能很好地解决血清带来的一些问题，例如公开号为CN 104630138 A的专利技术专利公开了一种无血清软骨细胞培养液，但是，由于软骨细胞属于贴壁生长类细胞，上述专利各类组分中缺乏促贴壁相关蛋白以及蛋白酶抑制剂，易造成细胞生长贴壁不稳固等问题，另外，存在延缓软骨细胞去分化效率低的问题，软骨细胞体外培养易出现去分化，导致胶原蛋白表达发生变化。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中存在的问题，提供一种软骨细胞无血清培养基，不仅解决了现有技术中的血清培养基带来的问题，而且软骨细胞生长过程中很好的贴壁并增值速度更快，有利于获得更多细胞量，同时在软骨细胞增殖的同时能够保持软骨细胞的特性，未出现明显的去分化现象。本专利技术的另一目的在于提供一种软骨细胞无血清培养基的制备方法。本专利技术通过以下技术方案实现该目的：一种软骨细胞无血清培养基，由基础培养基、血清替代物以及生长因子组成，其中：所述基础培养基为DMEM培养基、F12培养基或者二者的混合物；所述血清替代物包括：葡聚糖5-20g/L、脂类浓缩剂0.1-1ml/L、丙酮酸钠50-100mg/L、三碘甲状腺氨酸0.01-2uM、氢化可的松0.05-5mg/L、地塞米松0.1-10ug/L、亚硒酸钠1-5ug/L、β-巯基乙醇25-50uM、维生素C10-100mg/L、谷氨酰胺50-500ug/ml、转铁蛋白1-20mg/L、胰岛素或胰岛素样生长因子5-100ug/L、生长激素10-200ug/L、孕酮5-20nM、丁二胺20-100uM、氯化胆碱2.5-3.2mg/L、层粘连蛋白5-30ug/L、大豆蛋白酶抑制剂2-10mg/L；L-精氨酸250.0-320.0mg/L、L-门冬氨酸12.00-25.00mg/L、L-谷氨酸15.0-25.0mg/L、甘氨酸8.0-12.0mg/L、L-组氨酸13.0-16.0mg/L、L-羟脯氨酸18.0-22.0mg/L、L-异亮氨酸35.0-55.0mg/L、L-亮氨酸40.0-60.0mg/L、L-甲硫氨酸12.0-18.0mg/L、L-苯丙氨酸12.0-18.0mg/L、L-脯氨酸18.0-22.0mg/L、L-丝氨酸25.0-32.0mg/L、L-苏氨酸18.0-22.0mg/L、L-色氨酸2.0-6.0mg/L、L-酪氨酸20.19-25.89mg/L、L-缬氨酸18.0-22.0mg/L；所述生长因子包括：碱性成纤维生长因子5-60ug/L、表皮生长因子0.5-30ug/L、转化生长因子1-25ug/L、骨形成蛋白1-20ug/L、血小板衍生生长因子1-18ug/L、bHLH转录因子0.2-5ug/L、转录因子E2F-1 0.01-2ug/L。作为优选的，软骨细胞无血清培养基，由基础培养基、血清替代物以及生长因子组成，其中：所述基础培养基为DMEM培养基、F12培养基或者二者的混合物；所述血清替代物包括：葡聚糖10g/L、脂类浓缩剂0.5ml/L、丙酮酸钠80mg/L、三碘甲状腺氨酸0.2uM、氢化可的松2mg/L、地塞米松0.2ug/L、亚硒酸钠2ug/L、β-巯基乙醇25uM、维生素C50mg/L、谷氨酰胺200ug/mL、转铁蛋白5mg/L、胰岛素或胰岛素样生长因子40ug/L、生长激素20ug/L、孕酮10nM、丁二胺50uM、氯化胆碱2.5mg/L、层粘连蛋白12ug/L、大豆蛋白酶抑制剂6mg/L；L-精氨酸300mg/L、L-门冬氨酸20mg/L、L-谷氨酸20mg/L、甘氨酸10mg/L、L-组氨酸15mg/L、L-羟脯氨酸20mg/L、L-异亮氨酸40mg/L、L-亮氨酸60mg/L、L-甲硫氨酸15mg/L、L-苯丙氨酸15mg/L、L-脯氨酸20mg/L、L-丝氨酸30mg/L、L-苏氨酸20mg/L、L-色氨酸5mg/L、L-酪氨酸22mg/L、L-缬氨酸20mg/L；碱性成纤维生长因子20ug/L、表皮生长因子5ug/L、转化生长因子10ug/L、骨形成蛋白5ug/L、血小板衍生生长因子18ug/L、bHLH转录因子0.2ug/L、转录因子E2F-1 0.05ug/L。一种软骨细胞无血清培养基的制备方法，包括如下步骤：选取基础培养基，DMEM培养基、F12培养基或者二者的混合物；常温无菌环境下，向基础培养基中添加血清替代物和相关生长因子；0.22um滤膜过滤除菌，得到软骨细胞无血清培养基。相对于现有技术，本专利技术的有益效果为：本专利技术的软骨细胞无血清培养基，由基础培养基、血清替代物以及生长因子组成，不仅解决了现有技术中的血清培养基带来的问题，而且软骨细胞生长过程中很好的贴壁并增值速度更快，有利于获得更多细胞量，同时在软骨细胞增殖的同时能够保持软骨细胞的特性，未出现明显的去分化现象。附图说明图1为对比例1的细胞形态图。图2为对比例2的细胞形态图。图3为实施例1的细胞形态图。图4为实施例2的细胞形态图。图5为实施例3的细胞形态图。图6为5组细胞培养增殖曲线图。其中，组1表示对比例1，组2表示对比例2，组3表示实施例1，组4表示实施例2，组5表示实施例3。具体实施方式以下结合附图及具体实施例对本专利技术进行详细描述。实施例1。一种软骨细胞无血清培养基，由基础培养基、血清替代物以及生长因子组成，其中：所述基础培养基为DMEM培养基；所述血清替代物包括：葡聚糖5g/L、脂类浓缩剂0.1ml/L、丙酮酸钠50mg/L、三碘甲状腺氨酸0.01uM、氢化可的松0.05mg/L、地塞米松0.1ug/L、亚硒酸钠1ug/L、β-巯基乙醇25uM、维生素C10mg/L、谷氨酰胺50ug/ml、转铁蛋白1mg/L、胰岛素或胰岛素样生长因子本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种软骨细胞无血清培养基，由基础培养基、血清替代物以及生长因子组成，其中：所述基础培养基为DMEM培养基、F12培养基或者二者的混合物；所述血清替代物包括：葡聚糖5‑20g/L、脂类浓缩剂0.1‑1ml/L、丙酮酸钠50‑100mg/L、三碘甲状腺氨酸0.01‑2uM、氢化可的松0.05‑5mg/L、地塞米松0.1‑10ug/L、亚硒酸钠1‑5ug/L、β‑巯基乙醇25‑50uM、维生素C10‑100mg/L、谷氨酰胺50‑500ug/ml、转铁蛋白1‑20mg/L、胰岛素或胰岛素样生长因子5‑100ug/L、生长激素10‑200ug/L、孕酮5‑20nM、丁二胺20‑100uM、氯化胆碱2.5‑3.2mg/L、层粘连蛋白5‑30ug/L、大豆蛋白酶抑制剂2‑10mg/L；L‑精氨酸250.0‑320.0mg/L、L‑门冬氨酸12.00‑25.00mg/L、L‑谷氨酸15.0‑25.0mg/L、甘氨酸8.0‑12.0mg/L、L‑组氨酸13.0‑16.0mg/L、L‑羟脯氨酸18.0‑22.0mg/L、L‑异亮氨酸35.0‑55.0mg/L、L‑亮氨酸40.0‑60.0mg/L、L‑甲硫氨酸12.0‑18.0mg/L、L‑苯丙氨酸12.0‑18.0mg/L、L‑脯氨酸18.0‑22.0mg/L、L‑丝氨酸25.0‑32.0mg/L、L‑苏氨酸18.0‑22.0mg/L、L‑色氨酸2.0‑6.0mg/L、L‑酪氨酸20.19‑25.89mg/L、L‑缬氨酸18.0‑22.0mg/L；所述生长因子包括：碱性成纤维生长因子5‑60ug/L、表皮生长因子0.5‑30ug/L、转化生长因子1‑25ug/L、骨形成蛋白1‑20ug/L、血小板衍生生长因子1‑18ug/L、bHLH转录因子0.2‑5ug/L、转录因子E2F‑1 0.01‑2ug/L。...

【技术特征摘要】
1.一种软骨细胞无血清培养基，由基础培养基、血清替代物以及生长因子组成，其中：所述基础培养基为DMEM培养基、F12培养基或者二者的混合物；所述血清替代物包括：葡聚糖5-20g/L、脂类浓缩剂0.1-1ml/L、丙酮酸钠50-100mg/L、三碘甲状腺氨酸0.01-2uM、氢化可的松0.05-5mg/L、地塞米松0.1-10ug/L、亚硒酸钠1-5ug/L、β-巯基乙醇25-50uM、维生素C10-100mg/L、谷氨酰胺50-500ug/ml、转铁蛋白1-20mg/L、胰岛素或胰岛素样生长因子5-100ug/L、生长激素10-200ug/L、孕酮5-20nM、丁二胺20-100uM、氯化胆碱2.5-3.2mg/L、层粘连蛋白5-30ug/L、大豆蛋白酶抑制剂2-10mg/L；L-精氨酸250.0-320.0mg/L、L-门冬氨酸12.00-25.00mg/L、L-谷氨酸15.0-25.0mg/L、甘氨酸8.0-12.0mg/L、L-组氨酸13.0-16.0mg/L、L-羟脯氨酸18.0-22.0mg/L、L-异亮氨酸35.0-55.0mg/L、L-亮氨酸40.0-60.0mg/L、L-甲硫氨酸12.0-18.0mg/L、L-苯丙氨酸12.0-18.0mg/L、L-脯氨酸18.0-22.0mg/L、L-丝氨酸25.0-32.0mg/L、L-苏氨酸18.0-22.0mg/L、L-色氨酸2.0-6.0mg/L、L-酪氨酸20.19-25.89mg/L、L-缬氨酸18.0-22.0mg/L；所述生长因子包括：碱性成纤维生长因子5-60ug/L、表皮生长因子0.5-30ug/L、转化生长因子1-25ug/L、骨形成蛋白1-20ug/L、血小板衍生生长因子1-18ug/L、bHLH转录因...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈海佳，葛啸虎，王一飞，应杰，张维敏，
申请(专利权)人：广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44