一种水稻悬浮单细胞培养基及水稻单细胞的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种用于水稻悬浮单细胞培养的AA培养基，本发明专利技术培养基中，通过向基本培养基AA中加入丁香酚等激素，能够提高所培育水稻悬浮细胞的增殖速度。同时，本发明专利技术还提供了一种水稻悬浮单细胞的制备方法，本发明专利技术方法中，通过使用本发明专利技术中所述添加有丁香酚等特殊激素小分子化合物成分的基本培养基AA，从而提高了水稻悬浮单细胞的培养速度，同时也提高了制备水稻悬浮单细胞的效率。同时，本发明专利技术方法能用于粳米和籼米等不同种类水稻单悬浮细胞的制备，并且都能够实现单细胞的高效培养。因此，本发明专利技术方法具有适用范围广，单细胞培养效率高等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种水稻悬浮单细胞培养基及水稻单细胞的制备方法
本专利技术涉及单细胞培养领域，具体而言，涉及一种水稻悬浮单细胞培养基及水稻单细胞的制备方法。
技术介绍
悬浮单细胞是用来研究污染物对细胞制毒机制的重要试验材料，同时可用来制备原生质体，并进一步开展植物基因组、蛋白质组等操作研究，是一种重要的基础实验材料。制备悬浮单细胞难度较大，同一种作物的不同品种间制备悬浮单细胞的难易程度差异就很大。以水稻为例，粳稻的单细胞制备相对较容易，而籼稻品种则很难制备单细胞悬浮液。同时，现有技术中，制备水稻悬浮单细胞的培养时间也比较长，一般需要2－3个月的时间才能完成单细胞的培养，不仅耗时，也导致单细胞培养的成本升高。因此，开发一种能够针对不同品种的水稻进行有效悬浮单细胞培养，并且能够实现单细胞快速培养的方法，并提供一种能够提高愈伤组织增殖速度的培养液，也就成了目前亟待解决的技术问题。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一种水稻悬浮单细胞培养基，通过在单细胞培养过程中使用添加有丁香酚等特殊激素小分子化合物成分的基本培养基AA，从而能够水稻悬浮单细胞的增殖速度，同时也提高了制备水稻悬浮单细胞的效率。本专利技术的第二目的在于提供一种水稻悬浮单细胞的制备方法，所述的方法中通过改进培养基成分，在基本培养基AA中加入丁香酚等激素成分，从而使得本专利技术方法能够在较短的时间内制备得到多种水稻品种的悬浮单细胞，进而可以解决现有技术中方法适用面窄，耗时多而且成本高的技术问题。本专利技术方法能够适用于多种水稻品种悬浮单细胞的制备，并且能够缩短了悬浮单细胞制备的时间，具有应用范围广、悬浮单细胞制备速度快等优点。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：本专利技术提供了一种用于水稻悬浮单细胞培养的AA液体培养基，所述培养基是由2，4－D，KT(激动素)，丁香酚以及蔗糖溶解于基本培养基AA中而制成的。其中，丁香酚在所述培养基中的浓度为0.1－1mg/L。本专利技术培养基中，通过向基本培养基AA中加入丁香酚等激素成分，从而能够促进愈伤组织增殖，并进一步提高单细胞的制备速度。可选的，本专利技术所述AA液体培养基中各组分浓度为：2，4－D1－5mg/L；KT0.1－1mg/L；丁香酚0.1－1mg/L；蔗糖15－40g/L。同时，本专利技术还提供了一种水稻悬浮单细胞的制备方法，其包括如下步骤：将水稻种子去壳后预培养，然后切胚诱导愈伤组织培养，然后将得到的愈伤组织进行继代培养基；选取继代培养的愈伤组织，并接种于AA液体培养基中，并将接种后的培养基进行超声振荡处理，然后进行震荡培养，即得到水稻悬浮单细胞；其中，所述AA液体培养基是将2，4－D，KT(激动素)，丁香酚以及蔗糖溶解于基本培养基AA中而制成的。本专利技术方法中，通过使用添加有丁香酚等特殊激素小分子化合物成分的基本培养基AA，从而提高了水稻悬浮单细胞的培养速度，同时也提高了制备水稻悬浮单细胞的效率。同时，本专利技术方法适用于多种水稻悬浮单细胞的培养，适用范围广。可选的，本专利技术中，所述水稻种子为粳稻种子或籼稻种子。可选的，本专利技术中，所述水稻种子为生长饱满的水稻种子。可选的，本专利技术中，所述去壳为除去颖壳。可选的，本专利技术中，所述切胚为将预培养后所得到的培养水稻种子沿盾片方向切胚，然后将切片(即盾面)组织置于培养基上进行诱导培养。可选的，本专利技术中，所述继代培养中，每3天替换继代培养基1次。具体的，所述替换继代培养基为将培养基中2/3上的上清液倒出，然后加入等量的新鲜培养基。可选的，本专利技术中，选取的愈伤组织为继代1次的愈伤组织。可选的，本专利技术中，选取的继代培养的愈伤组织为生长旺盛且结构松散的愈伤组织。可选的，本专利技术中，选取的继代培养的愈伤组织重量为0.5－1g。可选的，本专利技术中，所述AA液体培养基在配置完成后，先经过高温灭菌再作为培养基应用。可选的，本专利技术中，AA液体培养基的用量为20－50ml。可选的，本专利技术中，所述AA液体培养基pH为5.5－5.9；优选的，本专利技术中，所述AA液体培养基pH为5.7－5.8。可选的，本专利技术中，所述振荡培养是在回旋式摇床上进行的。可选的，本专利技术中，所述振荡培养是在黑暗条件下进行的。可选的，本专利技术中，所述AA液体培养基中，各组分浓度为：基2，4－D1－5mg/L；KT0.1－1mg/L；丁香酚0.1－1mg/L；蔗糖15－40g/L。优选的，本专利技术中，所述AA液体培养基中，各组分浓度为：2，4－D2－3mg/L；KT0.2－0.5mg/L；丁香酚0.2－0.5mg/L，蔗糖20－30g/L；更优选的，本专利技术中，所述AA液体培养基中，各组浓度为：2，4－D2mg/L；KT0.2mg/L；丁香酚0.2mg/L，蔗糖20－30g/L。可选的，本专利技术中，还进一步包括将去壳后水稻种子用酒精消毒，并用次氯酸钠处理的步骤。可选的，本专利技术中，所述酒精消毒为将去壳后水稻种子浸泡于50％－75％的酒精中进行消毒。可选的，本专利技术中所述消毒的时间1－10min；优选的，本专利技术中，所述消毒的时间为5－7min。可选的，本专利技术中，还包括将消毒后的水稻种子用无菌水进行冲洗的步骤；可选的，所述冲洗为1－3次冲洗。可选的，本专利技术中，所述次氯酸钠溶液的为0.05－0.3mol/L；优选的，所述次氯酸钠的浓度0.1－0.2mol/L。可选的，本专利技术中，所述次氯酸钠处理为将种子浸泡于次氯酸钠溶液中。可选的，本专利技术中，次氯酸钠处理的时间为10－30min；优选的，次氯酸钠处理的时间为20－25min。可选的，本专利技术中，所述次氯酸钠处理是在振荡条件下进行的；优选的，本专利技术中，所述振荡为每5min振荡一次。可选的，本专利技术中，所述次氯酸钠处理的时间为10－30min；优选的，本专利技术中，所述次氯酸钠处理的时间为20min。可选的，本专利技术中，还包括在次氯酸钠处理后，再经无菌水冲洗的步骤。可选的，所述无菌水冲洗的次数为1－10次；优选的，所述无菌水冲洗的次数为4－6次。可选的，本专利技术中，所述预培养、诱导愈伤组织培养以及继代培养所用培养基均为添加有2，4－D、KT、蔗糖、琼脂的基本培养基LS，其中，各组分浓度为：2，4－D1－5mg/L；KT0.05－0.3mg/L；蔗糖20－50g/L；琼脂5－15g/L。本专利技术中，通过对对预培养、诱导愈伤组织培养以及继代培养所用培养基的选择和优化，并使用添加有激素和营养物质的基本培养基LS，从而使得处理后水稻种子能够快速发育，所得到的愈伤组织也能够快速增殖，从而提高了悬浮单细胞培养的整体流程速度，提高单细胞培养效率。可选的，本专利技术中，所述添加有2，4－D、KT、蔗糖、琼脂的基本培养基LS液体培养基pH为5.5－5.9；优选的，本专利技术中，所述培养基pH为5.7－5.8。可选的，本专利技术中，所述培养基中各组分浓度量为：2，4－D2.5－4.5mg/L；KT0.10－0.15mg/L；糖30－40g/L；琼脂7－12g/L；优选的，本专利技术中所述培养基中各组分浓度2，4－D2.5mg/L；KT0.1mg/L；糖30g/L；琼脂7g/L。可选的，本专利技术中，所述预培养、愈伤组织诱导培养以及继代培养的温度为20－30℃；优选的，所述培养的温度为25－27℃。本专利技术中，通过对所述培养温度的调整和优化，从而进一步优本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于水稻悬浮单细胞培养的AA液体培养基，其特征在于，所述培养基是由2，4－D，KT，丁香酚以及蔗糖溶解于基本培养基AA中而制成的；其中，丁香酚在所述培养基中的浓度为0.1－1mg/L。

【技术特征摘要】
1.一种用于水稻悬浮单细胞培养的AA液体培养基，其特征在于，所述培养基是由2，4－D，KT，丁香酚以及蔗糖溶解于基本培养基AA中而制成的；其中，丁香酚在所述培养基中的浓度为0.1－1mg/L。2.根据权利要求1所述的AA液体培养基，其特征在于，所述AA液体培养基中，2，4－D的浓度为1－5mg/L，KT的浓度为0.1－1mg/L，丁香酚的浓度为0.1－1mg/L，蔗糖的浓度为15－40g/L。3.一种利用权利要求1或2所述的AA液体培养基制备水稻悬浮单细胞的方法，其特征在于，其包括如下步骤：将水稻种子去壳后进行预培养，然后切胚诱导愈伤组织培养，然后将得到的愈伤组织进行继代培养基；选取继代培养的愈伤组织，并接种于权利要求1或2所述的AA液体培养基中，并将接种后的培养基进行超声振荡处理，然后进行震荡培养，即得到水稻悬浮单细胞。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还进一步包括将去壳后水稻种子用酒精消毒，并用次氯酸钠处理的步骤。5.根据权利要求4所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄永春，李文华，张长波，黄益宗，
申请(专利权)人：农业部环境保护科研监测所，
类型：发明
国别省市：天津,12