本发明专利技术公开了一种用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基及其制备方法，所述用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基包括：基础代谢营养物、核苷酸、维生素、无机盐、剪切力保护剂、抗细胞结团剂、酸碱度缓冲剂、酸碱度指示剂、流感病毒增殖促进剂和其它添加物；所述用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基的制备方法，包括以下步骤：1)制备混合液：将原料溶解并混合；2)调节pH：调节混合液的pH至6.3～6.7，定容后得到用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基；该培养基支持MDCK单细胞高密度全悬浮培养，大大缩短了MDCK细胞由贴壁细胞驯化成无血清的全悬浮细胞驯化时间，适用于生物制品特别是兽用生物制品的大规模生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及无血清培养基制备领域，具体涉及一种用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基及其制备方法。
技术介绍
犬肾脏上皮细胞(Madin-Darby canine kidney cell,MDCK)被视为最适用于甲、乙型流感病毒疫苗生产的细胞系之一，可被用于代替鸡胚培养流感病毒。目前已经开发了利用MDCK细胞系代替鸡胚培养流感病毒的微载体贴壁培养生产工艺方法，虽然此工艺方法以可达到的一定的生产规模，然而还是存在一定的缺陷：1、微载体难以多次重复使用，造成生产成本提高；2、贴壁细胞的培养密度受到贴壁面积的限制，致使病毒产量的下降；3、贴壁培养通常需添加血清以帮助细胞贴附和生长，需要进行换液，工艺复杂，并且会引入支原体、衣原体或动物蛋白的污染，对疫苗产品的安全性造成潜在威胁。人们越来越关注大规模无血清全悬浮培养MDCK细胞的技术。有关MDCK细胞在无血清培养基中全悬浮培养的报道较少。目前，国内极少商品化的适于MDCK细胞大规模全悬浮培养的无血清培养基。现有的技术当中，该无血清培养基均含有转铁蛋白等比较昂贵的动物源性蛋白等成分，不利于兽用生物制品的开发。因此，有必要开发组分明确、配制和使用方便、成本更低、适用于大规模生产兽用生物制品的MDCK单细胞悬浮培养的无血清培养基，使得MDCK细胞能简单快速从有血清贴壁生长状态驯化到无血清悬浮生长状态，建立更加先进的MDCK细胞无血清高密度悬浮培养工艺。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的之一在于提供一种用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基，该培养基支持MDCK单细胞高密度全悬浮培养，大大缩短了MDCK细胞由需血清贴壁培养细胞驯化成无血清的全悬浮细胞驯化时间，适用于生物制品特别是兽用生物制品的大规模生产。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基，所述用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基中，各组分的浓度为：基础代谢营养物:核苷酸:维生素:无机盐：酸碱度缓冲剂：碳酸氢钠 1000～3000mg/L；酸碱度指示剂：酚红 5～15mg/L；流感病毒增殖促进剂：其它添加物：作为本专利技术的一种优选的方案：所述用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基中，各组分的浓度为：基础代谢营养物:核苷酸:维生素:无机盐：酸碱度缓冲剂：碳酸氢钠 2200mg/L；酸碱度指示剂：酚红 8mg/L；流感病毒增殖促进剂：其它添加物：作为本专利技术的一种优选的方案：所述剪切力保护剂为嵌段式聚醚F68。作为本专利技术的一种优选的方案：所述抗细胞结团剂为硫酸葡聚糖。本专利技术的另一个目的在于提供一种用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基的制备方法，该方法简单快捷效率高，有利于大规模生产。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：上述用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基的制备方法，包括以下步骤：1)制备混合液：采用以下其中之一的方法将原料溶解并混合：Ⅰ)将原料混合后磨成细粉，然后将所得细粉于10～30℃溶剂中溶解，得到混合液；Ⅱ)将原料分别溶解于溶剂中，获得原料溶液；然后将所得原料溶液在温度为10～30℃的条件下混合，得到混合液；2)调节pH：调节混合液的pH至6.3～6.7，定容后得到用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基。作为本专利技术的一种优选的方案，步骤1)中，所述溶剂为无热源超纯水。作为本专利技术的一种优选的方案，所述步骤2)中，加入氢氧化钠调节所得混合液的pH值。本专利技术的有益效果在于：1、本专利技术所述用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基不含动物血清、成本低；支持MDCK单细胞高密度全悬浮培养，其成分明确、容易配制并且使用方便；2、本专利技术所述的培养基有效地缩短了MDCK细胞由需血清贴壁培养细胞驯化成无血清的全悬浮细胞驯化时间，提高了生产的效率，获得了高质量的全悬浮细胞；3、本专利技术的制备方法，简单快捷效率高，有利于大规模生产。附图说明：图1为实施例4中活细胞密度和细胞活性曲线图；图2为实施例5中需血清贴壁培养状态下MDCK细胞形态图；图3为实施例5中经本专利技术无血清培养基驯化下的MDCK细胞形态图；图4为实施例5中采用Hyclone公司无血清培养基SFM4 Mega Vir通过直接驯化法得到的悬浮培养的MDCKS细胞形态图；图5为实施例5中采用Gibco公司开发的商业无血清培养基SMI F8间接法驯化得到的MDCK.SUS2细胞形态图。具体实施方式下面，结合具体实施方式，对本专利技术做进一步描述：具体实施方式：一种用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基，所述用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基中，各组分的浓度为：基础代谢营养物:核苷酸:维生素:无机盐：剪切力保护剂：嵌段式聚醚F68 500～2500mg/L；抗细胞结团剂：硫酸葡聚糖 20～150mg/L；酸碱度缓冲剂：碳酸氢钠 1000～3000mg/L；酸碱度指示剂：酚红 5～15mg/L；流感病毒增殖促进剂：其它添加物：其中，核苷酸中选用次黄嘌呤和胸苷，能促进MDCK细胞的核苷酸合成，保证细胞的生长；次黄嘌呤和胸苷成分太高，会抑制细胞生长；其中，其他添加物中选用柠檬酸铁铵，用以替代转铁蛋白发挥其原有作用，不影响细胞生长与铁代谢，且能减少无血清培养基中的动物蛋白成分，降低培养基成本和对生产的不确定性和不安全性；柠檬酸铁铵依靠二价金属离子通道DMT1吸收铁，转铁蛋白通过转铁蛋白受体吸收铁，前者比后者提高了MDCK细胞对铁的吸收速率；柠檬酸铁铵成分浓度过高会抑制MDCK细胞生长；浓度太低，MD CK细胞对铁的吸收不足；其中，其它添加物中胰岛素的浓度在2～15mg/L，能促进葡萄糖代谢，保证MDCK细胞的生长和维持MDCK细胞的活性；其中，其它添加物中大豆水解物的浓度在1000～5000mg/mL，能保证维生素、金属离子、氨基酸等其他辅因子的供给，提高MDC K细胞对氨基酸的摄取；上述用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基的制备方法，包括以下步骤：1)制备混合液：采用以下其中之一的方法将原料溶解并混合：Ⅰ)将原料混合后磨成细粉，然后将所得细粉于10～30℃无热源超纯水中溶解，得到混合液；Ⅱ)将原料分别溶解于无热源超纯水中，获得原料溶液；然后将所得原料溶液在温度为10～30℃的条件下混合，得到混合液；2)调节pH：加入氢氧化钠调节混合液的pH至6.3～6.7，定容后得到用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基。具体实施例：实施例1本实施例公开了一种用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基，所述用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基中，各组分的浓度为：基础代谢营养物:核苷酸:维生素:无机盐：剪切力保护剂：嵌段式聚醚F68 1000mg/L；抗细胞结团剂：硫酸葡聚糖 25mg/L；酸碱度缓冲剂：碳酸氢钠 2200mg/L；酸碱度指示剂：酚红 8mg/L；流感病毒增殖促进剂：其它添加物：根据以下步骤制备用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基：1)将上述原料混合后磨成细粉，然后将所得细粉于10～30℃无热源超纯水中溶解，使得各原本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基，其特征在于：所述用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基中，各组分的浓度为：基础代谢营养物:核苷酸:维生素:无机盐：剪切力保护剂： 500～2500mg/L；抗细胞结团剂： 20～150mg/L；酸碱度缓冲剂：碳酸氢钠 1000～3000mg/L；酸碱度指示剂：酚红 5～15mg/L；流感病毒增殖促进剂：其它添加物：
【技术特征摘要】
1.一种用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基，其特征在于：所述用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基中，各组分的浓度为：基础代谢营养物:核苷酸:维生素:无机盐：剪切力保护剂： 500～2500mg/L；抗细胞结团剂： 20～150mg/L；酸碱度缓冲剂：碳酸氢钠 1000～3000mg/L；酸碱度指示剂：酚红 5～15mg/L；流感病毒增殖促进剂：其它添加物：2.如权利要求1所述用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基，其特征在于：所述用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基中，各组分的浓度为：基础代谢营养物:核苷酸:维生素:无机盐：剪切力保护剂： 1600mg/L；抗细胞结团剂： 50mg/L；酸碱度缓冲剂：碳酸氢钠 2200mg/L；酸碱度指示剂：酚红 8mg/L；流感病毒增殖促进剂：其它添加物：3.如权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈瑞爱，赖汉漳，刘玉鹏，詹烜子，刘旭平，麦康聪，汤钦，盘伟岚，许东蕾，陈华坚，
申请(专利权)人：广东温氏大华农生物科技有限公司，华东理工大学，肇庆大华农生物药品有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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