一种TIL细胞体外扩增培养基组合和培养方法技术

本公开涉及一种TIL细胞体外扩增培养基组合，包括诱导培养基、增殖培养基和活化适应培养基；所述诱导培养基的组成成分包括：基础培养基、灭活动物血清、香菇多糖、黄芪多糖、党参多糖和枸杞多糖；所述增殖培养基的组成成分包括：基础培养基、灭活动物血清、白细胞介素和单克隆抗体；所述活化适应培养基包括：基础培养基、胰岛素、转铁蛋白和谷氨酰胺。通过上述技术方案，利用本公开所提供的TIL细胞体外扩增培养基组合和方法培养获得的TIL细胞数量更多，在临床治疗中也具有更高的靶细胞杀伤活性。

【技术实现步骤摘要】
一种TIL细胞体外扩增培养基组合和培养方法
本公开涉及生物
，具体地，涉及一种TIL细胞体外扩增培养基组合和培养方法。
技术介绍
肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)是浸润于肿瘤组织中以肿瘤抗原特异性CD4+、CD8+T细胞为主，同时包括B细胞和NK细胞的细胞群。因TIL与肿瘤细胞密切接触，理论上可以对肿瘤细胞产生特异性的杀伤作用。TIL疗法是一种肿瘤特异性的细胞免疫疗法，将体外培养增殖后的TIL回输到体内，其在血液及肿瘤中可以长时间存活并行使杀伤功能。该方法具有高效、特异、副作用小等优点，可应用于实体瘤和各类晚期癌性胸、腹水患者的治疗。目前临床应用的TIL的来源主要有两个方面：1、手术切除的肿瘤组织或淋巴结；2、癌性胸腹水。常规的TIL细胞培养方法受肿瘤大小、肿瘤浸润程度以及胸腹水量等诸多因素的限制，细胞在培养过程中的增殖速度慢、增殖倍率低，培养获得的细胞往往杀伤活性较差从而不能满足临床治疗的要求。此外，由于TIL不仅包含肿瘤杀伤性CD8+T细胞(CTL)，而且还包含抑制CTL抗肿瘤功能的调节型CD4+CD25+T细胞(Treg细胞)和髓系衍生抑制细胞(MDSC)。现有的TIL细胞扩增方法中往往通过使用大量IL-2的方式刺激肿瘤组织或胸腹水中淋巴细胞增殖，然而IL-2用量过高可使培养的TIL中CD4+CD25+Treg细胞数量增加，令其难于有效发挥肿瘤杀伤效应，导致肿瘤免疫逃逸发生。因此有必要开发一种适用于大量扩增有杀伤活性TIL细胞的技术从而为其临床应用提供技术支持。
技术实现思路
本公开的目的是提供一种适用于大量扩增有杀伤活性TIL细胞的技术。为了实现上述目的，本公开提供一种TIL细胞体外扩增培养基组合，包括诱导培养基、增殖培养基和活化适应培养基；所述诱导培养基的组成成分包括：基础培养基、灭活动物血清、香菇多糖、黄芪多糖、党参多糖和枸杞多糖；所述增殖培养基的组成成分包括：基础培养基、灭活动物血清、白细胞介素和单克隆抗体；所述活化适应培养基包括：基础培养基、胰岛素、转铁蛋白和谷氨酰胺。可选地，所述白细胞介素为IL-7、IL-12和IL-15中的至少一种。可选地，所述白细胞介素为IL-7、IL-12和IL-15。可选地，所述单克隆抗体为CD3单克隆抗体、CD134单克隆抗体和PD-1单克隆抗体中的至少一种。可选地，所述基础培养基为AIM-V培养基和RPMI-1640培养基中的至少一种，所述灭活动物血清为胎牛血清。可选地，所述诱导培养基包括以下含量的各组分：香菇多糖20-50μg/mL、黄芪多糖20-50μg/mL、党参多糖20-50μg/mL、枸杞多糖20-50μg/mL、体积百分含量为5-10％的胎牛血清；AIM-V培养基与RPMI-1640培养基的体积比为1：1-1.4。可选地，所述增殖培养基包括以下含量的各组分：IL-75-15ng/mL、IL-125-15ng/mL、IL-155-15ng/mL、CD3单克隆抗体10-30ng/mL、CD134单克隆抗体10-30ng/mL、PD-1单克隆抗体10-30ng/mL、体积百分含量为5-10％的胎牛血清；AIM-V培养基与RPMI-1640培养基的体积比为1：1.2-1.6。可选地，所述活化适应培养基包括以下含量的各组分：胰岛素1.5-3μg/mL、转铁蛋白2-3μg/mL、谷氨酰胺1-2mM；AIM-V培养基与RPMI-1640培养基的体积比为1：2-4。本公开的第二个方面还提供了一种TIL细胞体外扩增培养方法，包括使用本公开第一个方面所述的TIL细胞体外扩增培养基组合，所述方法包括：诱导培养：将TIL细胞接种于诱导培养基中培养2-4天获得诱导培养细胞；增殖培养：将所述诱导培养细胞接种于增殖培养基中培养7-12天获得增殖培养细胞；活化适应：将所述增殖培养细胞接种于活化适应培养基中培养0.5-1.5天。可选的，所述方法还包括从胸腹水中提取TIL细胞：收集胸腹水，添加终浓度为12-15U/mL的肝素钠，用Ficoll分离液进行密度梯度离心收集单个核细胞；将所述单个核细胞用基础培养基重悬获得细胞悬液，用免疫磁珠对细胞悬液进行分选收集TIL细胞，再利用所述TIL细胞体外扩增培养基组合进行培养。可选的，所述诱导培养、增殖培养和活化适应在免疫细胞体外扩增装置中进行，所述装置包括细胞培养袋(1)和承载所述细胞培养袋(1)的承载台(3)，该装置还包括容纳于所述细胞培养袋(1)中的磁性浮球(2)以及在悬挂于所述细胞培养袋(1)上方并且能够驱动所述磁性浮球(2)在所述细胞培养袋(1)中移动的磁性悬挂驱动器(4)，所述磁性悬挂驱动器(4)包括能够吸引所述磁性浮球(2)的磁体片(41)和能够悬挂且驱动所述磁体片(41)在所述细胞培养袋(1)上方移动的悬挂驱动架(42)；所述细胞培养袋(1)中充有细胞培养液，述细胞培养液中含有培养基以及待扩增的细胞；所述磁性浮球(2)在浮力和磁力的合力作用下漂浮在培养液液面上；所述磁体片(41)能够在所述细胞培养袋(1)上方往复移动，从而通过磁力的作用，驱动所述磁性浮球(2)在漂浮状态下在培养液液面往复移动，所述磁性浮球(2)在培养液液面以下的部分能够搅拌培养液。本公开的专利技术人对于TIL细胞的体外扩增技术进行的大量的研究，意外的发现与细胞体外扩增培养体系中加入的IL-2相比较，加入IL-7和IL-15可得到与相同扩增倍数和体外功能的TIL。IL-7和IL-15既能够刺激T淋巴细胞的体外增殖，又能够维持中枢记忆CD8+T细胞的干性，促进CD8+T细胞产生IFN-γ，对肿瘤细胞起到直接杀伤作用，并减少CD4+CD25+Treg细胞的数量，发挥了协同增效的作用。故IL-7和IL-15联合使用可代替高剂量IL-2应用于TIL的体外扩增。同时，CD3单克隆抗体作为诱导剂活化和扩增CD8+T细胞；CD134单克隆抗体可刺激TIL中CD8+T细胞亚群的共刺激信号，促进细胞的活化，提高细胞穿孔素和颗粒酶的表达，增强其杀伤能力；PD-1单克隆抗体可促进CD8+T细胞扩增，加强细胞因子和颗粒酶分泌，提高对肿瘤细胞杀伤能力，并解除Treg细胞的免疫抑制作用。诱导培养过程中利用多糖类中药提取物减弱了MDSC的免疫抑制作用。通过上述技术方案，本公开所提供的TIL细胞体外扩增培养基不需要使用大量IL-2进行淋巴细胞刺激，进而避免了TIL细胞中含有大量Treg细胞和NK细胞的缺陷，增加了细胞在临床应用中的有效性。而且采用含有不同组分的按照一定的配比方式制备的培养基在细胞生产的特定阶段进行有针对性的培养，可以更好的满足TIL细胞在不同阶段的生长需求，培养基中的各组分发挥协同增效作用可以更有效的扩增和活化TIL细胞，培养获得的TIL细胞数量更多，细胞在临床治疗中也具有更高的活性。本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。附图说明附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：图1是本公开的免疫细胞体外扩增装置中一种可选的实施方式的切向示意图。图2是本公开的免疫细胞体外扩增装置中一种可选的实施方式的俯视示意图。图3是本公开的免疫细胞体外扩增装置中一种可选的实施本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种TIL细胞体外扩增培养基组合，包括诱导培养基、增殖培养基和活化适应培养基；所述诱导培养基的组成成分包括：基础培养基、灭活动物血清、香菇多糖、黄芪多糖、党参多糖和枸杞多糖；所述增殖培养基的组成成分包括：基础培养基、灭活动物血清、白细胞介素和单克隆抗体；所述活化适应培养基包括：基础培养基、胰岛素、转铁蛋白和谷氨酰胺。

【技术特征摘要】
1.一种TIL细胞体外扩增培养基组合，包括诱导培养基、增殖培养基和活化适应培养基；所述诱导培养基的组成成分包括：基础培养基、灭活动物血清、香菇多糖、黄芪多糖、党参多糖和枸杞多糖；所述增殖培养基的组成成分包括：基础培养基、灭活动物血清、白细胞介素和单克隆抗体；所述活化适应培养基包括：基础培养基、胰岛素、转铁蛋白和谷氨酰胺。2.根据权利要求1所述的培养基组合，其中，所述白细胞介素为IL-7、IL-12和IL-15中的至少一种。3.根据权利要求2所述的培养基组合，其特征在于，所述白细胞介素为IL-7、IL-12和IL-15。4.根据权利要求1-3中任意一项所述的培养基组合，其中，所述单克隆抗体为CD3单克隆抗体、CD134单克隆抗体和PD-1单克隆抗体中的至少一种。5.根据权利要求4所述的培养基组合，其中，所述基础培养基为AIM-V培养基和RPMI-1640培养基中的至少一种，所述灭活动物血清为胎牛血清。6.根据权利要求1-3和5所述的培养基组合，其中，所述诱导培养基包括以下含量的各组分：香菇多糖20-50μg/mL、黄芪多糖20-50μg/mL、党参多糖20-50μg/mL、枸杞多糖20-50μg/mL、体积百分含量为5-10％的胎牛血清；AIM-V培养基与RPMI-1640培养基的体积比为1：1-1.4。7.根据权利要求6所述的培养基组合，其中，所述增殖培养基包括以下含量的各组分：IL-75-15ng/mL、IL-125-15ng/mL、IL-155-15ng/mL、CD3单克隆抗体10-30ng/mL、CD134单克隆抗体10-30ng/mL、PD-1单克隆抗体10-30ng/mL、体积百分含量为5-10％的胎牛血清；AIM-V培养基与RPMI-1...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭天欢，杨小芳，何淑婷，
申请(专利权)人：浙江丹晖生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33