细胞培养基和方法技术

本发明专利技术描述了用于制备培养基、进料和补充物的组合物和方法。这样的方法和培养基可以表现出增加的不稳定组分的稳定性，且可以使用例如微米混悬液和/或包囊技术、螯合作用，和任选地，用抗氧化剂包被和/或混合不稳定化合物。所述组合物可以耐受热和/或辐照处理，且具有减少的病毒数目。这些技术可以产生具有延长的贮存期限、它们的内部组分向培养物中延长释放的产品，或可以使用最小体积产生可无菌地加入到生物反应器中的产品。所述组合物和方法可以优化生物生产工作流和增加效率。

Cell culture medium and method

Compositions and methods for preparing a culture medium, a feed, and a supplement are described. This method and medium can exhibit increased stability components, and such as micro suspension and / or encapsulation technology, chelation, and optionally coated with antioxidants and / or mixed unstable compounds. The composition can be resistant to heat and / or irradiation, and has a reduced number of viruses. These techniques can produce products with extended storage periods, their internal components, extended release to cultures, or products that can be added to the bioreactor in minimal volume. The compositions and methods can optimize a biological production workflow and increase efficiency.

【技术实现步骤摘要】
细胞培养基和方法本申请是2012年12月21日提交的同名专利技术专利申请201280068225.X的分案申请。
本文提供了与新类型的细胞培养基、进料和补充物有关的组合物、方法和用途。所述培养基、进料和补充物具有几种期望的性能，所述性能包括、但不限于：具有超过它们的正常溶解度限度的某些组分、增加的辐射耐受性、延长的释放性能、高溶解度、增加的贮存期限和热稳定性。在某些实施方案中，这样的特征将改善用户工作流和生物反应器生产力。附图说明下文描述的且并入本说明书中和构成本说明书的一部分的以下附图解释了示例性实施方案，它们不应当视为限制本公开内容的范围。图1显示了为制备细胞培养基、进料和/或补充物组分的微米/纳米混悬液而开发的新方法。图2显示了微米混悬液和液体进料的细胞生长、蛋白生产和递送的性能对比。微米混悬液在试验的条件下的性能与液体进料相当，并表现出比液体进料更高的递送效力。图3是包囊的微米混悬液珠子的示意图，所述珠子被另外包被以延长释放。图4显示了PLGA包衣对延迟组分从微囊化的微米混悬液制品内的释放的影响。a)上图：无包衣；b)下图：使用PLGAA和PLGAB的包衣的对比。A和B具有不同的丙交酯:乙交酯比率。具有85:15比率的PLGAB表现出良好的延长释放性能，并维持它的形状，具有在溶液中释放组分>15天的能力。图5显示了辐照对本公开内容的制品的影响。用以下物质培养的细胞中的蛋白生产效率的对比：i)辐照的微米混悬液；ii)干燥的、包囊的微米混悬液，其与iii)中的那些类似；iii)未辐照的对照液体进料，其通过过滤来灭菌。图6表明，当在辐照的试验进料中培养细胞时，大约30kGy的辐照不会负面地影响(a)细胞生长(上图)；或者，(b)蛋白生产(下图)。还试验了另外的补充物68和86，并且表现出类似的结果(数据未显示)。图7表明，γ辐照对微米混悬液和对干燥的、包囊的微米混悬液存在可忽略的影响。该图显示了与未辐照的液体对照相比，在微胶囊(“珠子”)中或作为微米混悬液(MS)，30kGy的γ如何影响包囊的化合物(参见最右侧)。NG＝没有γ辐照,和G＝γ-辐照。图8显示了包含不稳定组分的微囊化珠子的示意图，所述不稳定组分被包埋和/或包裹在抗氧化剂中以通过减少在辐照过程中产生的氧化物质的影响来保护不稳定的分子。图9显示了反应性物质的螯合作用以及痕量元素中的金属离子与氨基酸的示例性配位络合物的形成。图10显示了制备微米混悬液和包囊的微米混悬液的方法的示意图。图11显示了辐照的、微囊化的珠子向生物反应器中的直接添加的2种选择。左图显示了在可高压灭菌的多孔金属过滤器内添加的珠子；或者，右图表明，可以将珠子直接加入培养物中。图12：在以下情况下，使用多孔金属过滤器装置引入培养物中的补充物的延长释放的对比：(a)具有PLGA包衣的微米混悬液珠子：上图，和(b)没有珠子，仅AGT进料。专利技术概述在本公开内容中描述的培养基、进料和补充物组合物具有几种期望的性能，所述性能包括、但不限于：(i)以“超浓缩”水平递送某些组分的能力，所述“超浓缩”水平远远超过它们在培养系统中的正常溶解度限度，(ii)即使在辐射灭菌以后，增加的维持培养基/进料功能性的能力，(iii)增加的延长释放内部组分的能力，(iv)高溶解度且快速的溶解，(v)干燥形式下的较长的贮存期限，(vi)增加的热稳定性，(vii)多达8个log的减小的病毒污染风险，(viii)与其它灭菌技术(诸如UV、过滤和/或HTST巴氏消毒)相组合的能力，(ix)应用于多种培养基形式(诸如AGT、DPM、APM)以及具有较高浓度的不稳定组分的制剂的能力，(x)应用于多种产品类型(诸如培养基、进料、补充物、功能性添加剂等)的能力。由于这些特征，所述组合物可以直接加入生物反应器中或加入已经在进行中的培养物中，并由此可以改善用户工作流和生物反应器生产力。因此，在本公开内容中描述的组合物、方法和用途部分地涉及包含微米混悬液的细胞培养基、浓缩进料、功能性添加剂、补充物；还可以涉及包含一种或多种包囊的微米和/或纳米混悬液的新细胞培养基、进料和/或补充物组合物；还可以涉及使用辐射将以上组合物灭菌，使得所述培养基/进料的功能性即使在暴露于辐射以后也得到维持。本公开内容也提供了制备这样的培养基的方法，包括此类培养基的特征及其用途。贯穿本公开内容，有时可能仅提及细胞培养基，但是它在适用的情况下也包括进料和/或补充物。在一个实施方案中，本公开内容涉及一种制备培养基、进料或补充物组合物的方法，所述方法包括：将最小体积的水溶液加入到培养基、进料或补充物的干粉中以制备糊状物；和剧烈混合所述糊状物以制备微米混悬液。在另一个实施方案中，本公开内容涉及一种制备包含不稳定组分的组合物的方法，所述方法任选地包括：将有效量的抗氧化剂与所述不稳定组分的微米混悬液混合以形成混合物；将所述微米混悬液或步骤2中的混合物包囊在合适的囊材料中，使得形成微胶囊或珠子；和干燥所述微胶囊或珠子。在一个实施方案中，所述不稳定物质附着于树枝状聚合物。在这些实施方案的任一个中，所述囊材料可以选自，例如，海藻酸盐、聚-L-乳酸、壳聚糖、琼脂糖、明胶、透明质酸、硫酸软骨素、葡聚糖、硫酸葡聚糖、肝素、硫酸肝素、硫酸类肝素、结冷胶、黄原胶、瓜尔胶、水溶性的纤维素衍生物和角叉菜胶。在所述方法的另一个实施方案中，用延长所述不稳定组分从珠子的释放的材料进一步包被珠子。在另一个方面，所述包衣选自，例如，聚乙醇酸、PLGA(聚乳酸-共-乙醇酸)、胶原、聚羟基烷酸酯(PHA)、聚-ε-己内酯、聚原酸酯、聚酸酐、聚膦腈、聚氨基酸、聚二甲基硅氧烷、聚氨基甲酸酯、聚四氟乙烯、聚乙烯、聚砜、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸-2-羟基乙酯、聚酰胺、聚丙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯和聚乙烯吡咯烷酮。在一个实施方案中，辐照所述珠子，且在另一个实施方案中，用γ-射线辐照所述珠子。在某些实施方案中，另外用紫外射线辐照所述珠子，此后，所述珠子可以不具有PPV和MMV病毒。在几个实施方案中，所述培养基是干燥形式培养基，且要保护的不稳定组分选自：多胺、生长因子、细胞因子和维生素。在某些实施方案中，所述囊材料在用水性溶剂重构后是可溶的。在其它实施方案中，所述包囊基质包裹树枝状聚合物-不稳定组分复合物。在某些实施方案中，所述树枝状聚合物是聚酰胺胺树枝状聚合物、聚丙烯亚胺树枝状聚合物或聚丙胺(POPAM)树枝状聚合物。在以上实施方案中的任一个中，描述的方法可以例如实现关于培养基、进料、补充物或功能性添加剂的以下一项或多项：1)使它们更耐受辐照(例如，基于效力或功能性的保留而测量的)；2)增加在环境温度下的稳定性；3)允许一些组分的延长释放；4)增加在环境温度下的运输稳定性；5)增加对温度波动的稳定性。在以上方法中使用的组合物可以包含粉末状细胞培养基，所述粉末状细胞培养基还包含不稳定的化合物，和/或至少一种浓缩的组分。本公开内容也涉及下述组合物：包含培养基/进料组分的微米混悬液的培养基、进料或补充物组合物。在一个实施方案中，所述培养基、进料或补充物组合物包含不稳定组分和抗氧化剂的混合物，所述混合物被微囊化在囊基质内成为珠子。在另一个实施方案中，所述囊材料选自，例如，海藻酸盐、聚-L-乳酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备细胞培养基、细胞培养进料或细胞培养补充物的方法，所述方法包括：(a)将最小体积的水溶液加入到所述细胞培养基、细胞培养进料或细胞培养补充物的干粉中以制备糊状物；(b)剧烈混合所述糊状物以形成微米混悬液；(c)任选地，将有效量的抗氧化剂添加至所述微米混悬液，以形成混合物；将步骤(b)的微米混悬液或步骤(c)的混合物包囊在合适的囊材料中，使得形成微胶囊或珠子；干燥所述微胶囊或珠子，其中所述细胞培养基、细胞培养进料或细胞培养补充物包含不稳定物质。

【技术特征摘要】
2011.12.22 US 61/579,4321.一种制备细胞培养基、细胞培养进料或细胞培养补充物的方法，所述方法包括：(a)将最小体积的水溶液加入到所述细胞培养基、细胞培养进料或细胞培养补充物的干粉中以制备糊状物；(b)剧烈混合所述糊状物以形成微米混悬液；(c)任选地，将有效量的抗氧化剂添加至所述微米混悬液，以形成混合物；将步骤(b)的微米混悬液或步骤(c)的混合物包囊在合适的囊材料中，使得形成微胶囊或珠子；干燥所述微胶囊或珠子，其中所述细胞培养基、细胞培养进料或细胞培养补充物包含不稳定物质。2.一种培养基、进料或补充物组合物，其包含不稳定组分和抗氧化剂的混合物，所述混合物被囊基质微囊化为珠子，其中所述培养基、进料或补充物由权利要求1的方法制备。3.根据权利要求2所述的培养基、进料或补充物组合物，其中所述囊基质的材料选自：海藻酸盐、聚-L-乳酸、壳聚糖、琼脂糖、明胶、透明质酸、硫酸软骨素、葡聚糖、硫酸葡聚糖、肝素、硫酸肝素、硫酸类肝素、结冷胶、黄原胶、瓜尔胶、水溶性的纤维素衍生物和角叉菜胶。4.根据权利要求3所述的培养基、进料或补充物组合物，其中所述珠子被包衣溶液包被。5.根据权利要求4所述的培养基、进料或补充物组合物，其中所述包衣溶液选自：聚乙醇酸、聚乳酸-共-乙醇酸、胶原、聚羟基烷酸酯、聚-ε-己内酯、聚原酸酯、聚酸酐、聚膦腈、聚氨基酸、聚二甲基硅氧烷、聚氨基甲酸酯、聚四氟乙烯、聚乙烯、聚砜、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸-2-羟基乙酯、聚酰胺、聚丙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚-L-赖...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·菲克，S·巴雷特，江舟，D·贾德，
申请(专利权)人：生命技术公司，
类型：发明
国别省市：美国,US