一种人原代细胞培养基及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种原代细胞培养基，该培养基用于体外培养人原代细胞的用途，以及使用其体外培养人原代急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)细胞的方法。本发明专利技术所述培养基除基础培养基外还包括细胞因子：人FLT3L、人IGF1、人IL-7和人IL-6。所述培养基不含血清，并且可避免原代细胞与基质细胞的共培养，也解决了传统的含血清、与基质细胞共培养等培养方案所存在的一系列问题。与现有培养方式相比，使用本发明专利技术培养基进行的体外培养具有更高的扩增效率，和更长的体外培养时间。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及细胞培养
，具体地，涉及一种原代细胞培养基，该培养基用于体外培养人原代细胞的用途，以及使用其体外培养人原代急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)细胞的方法。
技术介绍
急性B淋巴细胞白血病(B-ALL，B-cellacutelymphoblasticleukemia)，也称为前体B细胞(preB-cell)急性淋巴细胞白血病，是来源于B细胞祖细胞的恶性肿瘤。B-ALL主要为儿童高发性癌症，在成人发病率下降。在B-ALL未成年患者中预后好，长期存活率(EFS，event-freesurvival)可达90％，但在B-ALL成人中却是预后差、低生存率。另外在成年B-ALL患者中，传统的化疗的效果差，死亡率约为60％。因此，针对B-ALL，需要研发新的有效治疗方法。迄今为止，B-ALL相关研究主要依赖于B-ALL细胞系，而细胞系在长期传代培养的过程中，对高浓度血清的非人体环境中逐渐适应，并形成了一些区别于原代肿瘤细胞的基因突变和细胞特性(如高表达p53突变)。尽管病人来源的B-ALL样本细胞可以通过异种移植入免疫缺陷小鼠中扩大增殖后，进行体内实验，然而体内研究花费高、耗时长，特别是对于新型治疗方法或药物筛选实验，耗费的人力物力是不可预估的。因此，对于B-ALL的相关研究需要借助于原代B-ALL细胞的体外培养。然而，人原代细胞在体外培养时容易分化、凋亡；目前的人原代B-ALL细胞培养方法主要是通过与基质细胞共培养、添加细胞因子的有血清培养基进行培养的。下面列举一些关于人原代B-ALL细胞培养的报道：2015年3月的一篇名为“B-cellprecursoracutelymphoblasticleukemiaandstromalcellscommunicatethroughGalectin-3”的文章中采用基质细胞OP9与B祖细胞白血病细胞系US7或TXL2共培养，所述共培养在含20％FBS的α-MEM中进行；2014年12月份的一篇名为“mTORkinaseinhibitorssynergizewithhistonedeacetylaseinhibitorstokillB-cellacutelymphoblasticleukemiacells”的文章中将儿童B系白血病细胞与人骨髓基质细胞MSC共培养，所述共培养在含10％FBS和细胞因子SCF、IL-3、IL-7、FLT3L的基础培养基中进行；一篇名为“MesenchymalstemcellspromoteleukaemiccellsaberrantphenotypefromB-cellacutelymphoblasticleukaemia”的文章中将骨髓间充质干细BM-MSC与B系急性白血病细胞共培养，并加入细胞因子SCF、TPO、FLT3L；2009年的一篇题为“Long–termcultureofprimaryhumanlymphoblasticleukemiacellsintheabsenceofserumorhematopoieticgrowthfactors”的文章中提及了原代淋巴细胞白血病细胞的体外培养基，其为添加细胞因子IL-3、IL-7、SCF的无血清IMDM培养基；该培养基中虽然不包含血清，然而，本专利技术的专利技术人使用该培养基进行了重复实验，发现无法实现文章中所述的培养效果，即，其稳定性有待考究；此外，WO2013155405A1中公开了基质细胞与T-ALL共培养的无血清培养基，该培养基包括EGF、氢化可的松、胰岛素、SCF、IGF-1、IL-2和IL-7等。需要注意的是，血清虽然在传统细胞体外生存和培养过程中是必需的，然而，在人原代细胞体外培养时，血清可加速原代细胞特别是造血系干细胞、祖细胞的分化和老化；并且，就血清本身而言，即使是同一品牌的血清，不同批次的血清之间都可能存在明显差异，从而使得培养效果也具有明显差异，所以使用含血清的培养基存在培养基成分不明确的问题，实用性相对不足。而与基质细胞共培养，不仅操作步骤麻烦，而且在共培养过程中，基质细胞(特别是永生化细胞系)的生长速度远超过原代细胞，其与原代细胞竞争吸收培养基中的营养，进而影响原代细胞的生长；此外，基质细胞通过蛋白分泌或受体结合激活原代细胞体外存活和扩增，然而这些激活因素与基质细胞的细胞状态、分化、老化、传代次数等不可控因素相关，导致以基质细胞共培养方法培养的原代细胞的培养效果会出现明显差异，难以重复实施，不利于推广应用。因此，本领域需要一种无需与基质细胞共培养的、不含血清的人原代细胞培养基。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新的原代细胞培养基，该培养基用于体外培养人原代细胞的用途，以及使用其体外培养人原代B-ALL细胞的方法。本专利技术的原代细胞培养基不含血清，并且，无需原代细胞与基质细胞共培养，即可实现理想的体外培养效果。本专利技术通过以下技术方案实现上述目的：第一方面，本专利技术提供了一种原代细胞培养基，其包括基础培养基和细胞因子组合；所述细胞因子组合包括人FLT3L、人IGF1、人IL-7和人IL-6。关于上述原代细胞培养基，作为优选，所述人FLT3L在培养基中的含量为5-100ng/ml、优选25-100ng/ml、更优选50-100ng/ml；在具体实施方案中，所述人FLT3L在培养基中的含量可以为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100ng/ml。优选地，所述人IGF1在培养基中的含量为5-100ng/ml、优选25-100ng/ml、更优选50-100ng/ml；在具体实施方案中，所述人IGF1在培养基中的含量可以为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100ng/ml。优选地，所述人IL-7在培养基中的含量为2-50ng/ml、优选10-50ng/ml、更优选20-50ng/ml；在具体实施方案中，所述人IL-7在培养基中的含量可以为2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50ng/ml。优选地，所述人IL-6在培养基中的含量为2-50ng/ml、优选10-50ng/ml、更优选20-50ng/ml；在具体实施方案中，所述人IL-6在培养基中的含量可以为2、3、4、5、6、7、8、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种原代细胞培养基，其包括基础培养基和细胞因子组合；所述细胞因子组合包括人FLT3L、人IGF1、人IL‑7和人IL‑6。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种原代细胞培养基，其包括基础培养基和细胞因子组合；所述细胞因子组合
包括人FLT3L、人IGF1、人IL-7和人IL-6。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述人FLT3L在培养基中的含
量为5-100ng/ml、优选25-100ng/ml、更优选50-100ng/ml；
优选地，所述人IGF1在培养基中的含量为5-100ng/ml、优选25-100ng/ml、更优
选50-100ng/ml；
优选地，所述人IL-7在培养基中的含量为2-50ng/ml、优选10-50ng/ml、更优选
20-50ng/ml；
优选地，所述人IL-6在培养基中的含量为2-50ng/ml、优选10-50ng/ml、更优选
20-50ng/ml。
3.根据权利要求1或2所述的培养基，其特征在于，所述培养基还包括牛血清白
蛋白、转铁蛋白和胰岛素中的任意一种或几种。
4.根据权利要求3所述的培养基，其特征在于，所述牛血清白蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：李鹏，蒋治武，林思妙，叶未，姚瑶，
申请(专利权)人：中国科学院广州生物医药与健康研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44