肌肉干细胞体外培养方法及其应用技术

本发明专利技术涉及肌肉干细胞体外培养方法及其应用。本发明专利技术的肌肉干细胞体外培养方法，为采用血液细胞的条件培养基体外培养肌肉干细胞。本发明专利技术还进一步公开了所述肌肉干细胞体外培养方法所用培养基及其应用。采用本发明专利技术的方法，肌肉干细胞可以增殖十次以上。更重要的是，在本发明专利技术的培养基中，肌肉干细胞可以连续传代，并继续保持干性和分化潜能，并且扩增后的肌肉干细胞均保持干性和完整分化潜能，能够在体内修复肌肉损伤，这就使得利用体外培养的肌肉干细胞用于再生医学治疗的策略在临床上具有可行性。

Muscle stem cell culture method and its application in vitro

The invention relates to a method for culturing muscle stem cells in vitro and uses thereof. The present invention relates to a method for culturing muscle stem cells in vitro, in which muscle stem cells are cultured in vitro using conditioned medium of blood cells. The present invention further discloses the medium for culturing the muscle stem cell in vitro and its application. With the method of the present invention, muscle stem cells can proliferate more than ten times. More importantly, in the culture medium of the invention, the muscle stem cells can be passaged and keep dry and differentiation potential, and amplified the muscle stem cells are kept dry and complete differentiation, can repair muscle damage in vivo, which makes use of in vitro cultured muscle stem cells for the treatment of regenerative medicine the control strategy is feasible in clinical practice.

【技术实现步骤摘要】
肌肉干细胞体外培养方法及其应用本案为以下专利申请的分案申请：申请号：201310205059X；申请日：2013年5月29日；专利技术名称：肌肉干细胞体外培养方法及其应用
本专利技术涉及生物技术与医学领域，特别涉及肌肉干细胞相关的细胞培养与细胞治疗领域。
技术介绍
肌肉干细胞负责出生后肌肉组织的生长和再生，且肌肉干细胞在体内没有致癌效果，不存在应用胚胎干细胞时会碰到的伦理问题，因而在肌肉萎缩和重症肌无力等各种肌肉退行性疾病的治疗方面有广阔的应用前景。肌肉干细胞临床应用的一个重要障碍是无法在体外长期培养肌肉干细胞。和大多数成体干细胞一样，肌肉干细胞从体内分离之后，在体外培养系统中只能再分裂2－4次，几乎无法传代。现有培养肌肉干细胞(卫星细胞)的方法几乎都来源于Bischoff博士在1986年建立的方法，后经过Beauchamp等人的改进，形成现有的在F10基础培养基中添加10ng/mlFGF进行培养的方法。在此培养条件下，肌肉干细胞可以增殖3－5次。在传代时，肌肉干细胞会经过一个严重的危机时期，在这一危机时期，绝大多数细胞都会死去，残留的细胞则分化为不具有干性的前体细胞。所以体外培养1－3代(3－12天)后，分离得到的肌肉干细胞即全部分化为不具有干性的前体细胞，肌肉干细胞的分子标记在这些前体细胞中都无法检测到。注射入小鼠体内后，这些前体细胞参与肌肉损伤修复的能力非常弱，不能在体内形成有功能的干细胞，完全不能进行移植后二次损伤的修复。(BischoffR.Asatellitecellmitogenfromcrushedadultmuscle.DevBiol.,1986.115(1):140-147.Beauchamp,J.R.,etal.,ExpressionofCD34andMyf5definesthemajorityofquiescentadultskeletalmusclesatellitecells.JCellBiol,2000.151(6):p.1221-34.)也就是说，采用现有的肌肉干细胞体外培养系统，培养后的肌肉干细胞传代后要经过一个危机期，危机期后得到的可以增殖的细胞绝大多数已经分化为肌肉祖细胞，丧失了肌肉损伤修复的能力。由于这一问题的存在，使得通过在肌肉干细胞中进行基因修复治疗遗传性的肌肉退行性疾病的方法难以在临床治疗中使用。
技术实现思路
本专利技术的目的就是克服现有技术的缺陷，提供一种肌肉干细胞培养基及其应用。本专利技术第一方面提供了一种肌肉干细胞体外培养方法，为采用添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基或血液细胞的条件培养基体外培养肌肉干细胞。本专利技术的肌肉干细胞体外培养方法适合体外长期培养肌肉干细胞。本专利技术第二方面提供了一种肌肉干细胞培养基，为添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基或血液细胞条件培养基。所述添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基中所添加的血液细胞的细胞因子，用于制备所述血液细胞条件培养基的血液细胞，均与待培养的肌肉干细胞来源于相同的动物物种。当添加动物血清培养细胞时，本专利技术所述的添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基中所添加的血液细胞的细胞因子并不包括所用动物血清中本就含有的细胞因子。所述添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基可由在通用细胞培养基中添加血液细胞的细胞因子的方法制备获得。进一步的，所述血液细胞条件培养基为淋巴细胞条件培养基。更进一步的，为B细胞条件培养基或T细胞条件培养基。所述添加的血液细胞的细胞因子选自以下细胞因子中的多种：GM-CSF(粒细胞集落刺激因子)、sICAM-1(人可溶性细胞间粘附分子1)；IFNgamma(γ干扰素)、IL1(白介素1)、IL-1alphareceptor(白介素1α受体)、IL1alpha(白介素1α)、IL-3(白介素3)、IL2(白介素2)、IL-10(白介素10)、IL-16(白介素16)、IL13(白介素13)、IL-17(白介素17)、IP-10(干扰素诱导蛋白10)、SCYA2(小诱导型细胞因子A2)、MIG(干扰素γ诱生单核因子)、MIP-1alpha(巨噬细胞炎性蛋白1α)、TGF－beta(转化生长因子β)、IL-4(白介素4)、TRAF6(TNF受体相关因子6)、FGF(成纤维细胞生长因子)、IGF胰岛素样生长因子)、PDGF(血小板衍生生长因子)、LIF(白血病抑制因子)、mTOR(哺乳动物雷帕霉素靶蛋白)、LPS(细胞内毒素)、TLR1(Toll-样受体1)、IL12(白介素12)、IL23(白介素23)、NGF(神经生长因子)、TNFalpha(α干扰素)、IL1beta(白介素1β)。所述添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基或血液细胞的条件培养基中，所述添加的血液细胞的细胞因子总浓度不低于6ng/ml，较佳地为50-4500ng/ml。进一步的，所述添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基或血液细胞的条件培养基中，任一添加的血液细胞的细胞因子的浓度均在0.5ng/ml以上，较佳的为1ng/ml以上，再佳的为10ng/ml以上，更佳的，25ng/ml以上，更进一步的，为50ng/ml以上。进一步的，所添加的述血液细胞的细胞因子至少包括IL1、IL4、IL13、TNFalpha、IL2和IFNgamma。进一步的，所述添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基或血液细胞的条件培养基中，IL1、IL4、IL13、TNFalpha、IL2和IFNgamma的浓度之和不低于6ng/ml，较佳地为50-1250ng/ml。进一步的，所述添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基或血液细胞的条件培养基中，所述IL1、IL4、IL13、TNFalpha、IL2和IFNgamma中任一种的浓度均不低于0.5ng/ml，较佳的为1ng/ml以上，更佳为10ng/ml以上，一般可选择50-500ng/ml。本专利技术第三方面，提供了前述血液细胞的细胞因子或血液细胞条件培养基在肌肉干细胞体外培养中的用途。所述血液细胞的细胞因子或血液细胞条件培养基可促进肌肉干细胞在体外的增殖并使体外增殖的肌肉干细胞保持干性。本专利技术第四方面，提供了一种用于治疗肌肉退行性疾病的制剂，为以采用本专利技术的肌肉干细胞体外培养方法培养获得的肌肉干细胞为主要活性成分的制剂。进一步的，所述制剂以来源于病人本体的肌肉干细胞采用本专利技术的肌肉干细胞体外培养方法培养获得的肌肉干细胞为主要活性成分。进一步的，所述制剂为注射剂、手术植入剂。所述制剂一般包含常用的制剂辅料。本专利技术第五方面，提供了一种对病人的肌肉退行性疾病细胞治疗方法，包括下列步骤：1)收集病人的肌肉干细胞；2)采用本专利技术的肌肉干细胞培养基体外扩增培养步骤1)收集的肌肉干细胞至得到足够多的肌肉干细胞；3)将获得的肌肉干细胞给药至病人肌肉损伤部位。其中步骤3)所述给药方式可采用注射剂的方式将肌肉干细胞肌肉注射至病人肌肉损伤部位。肌肉干细胞的注射剂可将扩增后的肌肉干细胞经胰酶消化从培养皿中取下后，重悬在生理盐水中获得。采用本专利技术的肌肉干细胞体外培养、传代方法，使得肌肉干细胞可以在体外大量扩增并保持干性，从而大大提高了可以用于再生医学治疗的干细胞的数量，使得由患者提供少量肌肉组织，分离肌肉干细胞，进行基因修复，体外扩增后将携带正确遗传信息本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肌肉干细胞体外培养方法，为采用血液细胞的条件培养基体外培养肌肉干细胞。

【技术特征摘要】
1.一种肌肉干细胞体外培养方法，为采用血液细胞的条件培养基体外培养肌肉干细胞。2.如权利要求1所述肌肉干细胞体外培养方法，其特征在于，用于制备所述血液细胞条件培养基的血液细胞，与待培养的肌肉干细胞来源于相同的动物物种。3.如权利要求2所述肌肉干细胞体外培养方法，其特征在于，所述血液细胞条件培养基为淋巴细胞条件培养基。4.如权利要求3所述肌肉干细胞体外培养方法，其特征在于，所述血液细胞条件培养基为B细胞条件培养基或T细胞条件培养基。5.如权利要求4所述肌肉干细胞体外培养方法，其特征在于，所述血液细胞的条件培养基中，IL1、IL4、IL13、TNFalpha、IL2和IFNgamma中任一种的浓度均不低于0.5ng/ml，较佳的为1ng/ml以上，更佳为10ng/ml以上，一般可选择50-500ng/ml。6.一种肌肉干细胞培养基，为血液细胞条件培养基。7.如权利要求6所述的肌肉干细胞培养基，其特征在于，用于制备所述血液细胞条件培养基的血液细胞与待培养的肌肉干细胞来源于相同的动物物种。8.如权利要求7所述的肌肉干细...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡苹，傅鑫，肖俊，郭恒江，李升，刘燕，王红艳，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：上海,31