一种NK细胞培养基及体外扩增NK细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种NK细胞培养基，包括基础培养基和添加物，添加物各组分及浓度为：8‑12g/L人血清白蛋白、2.5‑7.5mmol/L尼克酰胺、0.5‑2.0μmol/L来那度胺、8‑16mmol/L HEPES。本发明专利技术还公开一种体外扩增NK细胞的方法。利用本发明专利技术的NK细胞培养基及体外扩增NK细胞的方法，可扩增出数量大、活性高、杀伤性强的NK细胞。

【技术实现步骤摘要】
一种NK细胞培养基及体外扩增NK细胞的方法
本专利技术涉及细胞培养领域，特别是涉及一种NK细胞培养基及体外扩增NK细胞的方法。
技术介绍
自然杀伤细胞（naturalkillercell，NK）是机体重要的免疫细胞，主要分布在外周血中。NK细胞作为机体防御体系的第一道防线，不仅可以在天然免疫系统发挥其主要杀瘤效应，而且在免疫反应的早期可以分泌不同的细胞因子和各种趋化因子来调节机体获得性免疫应答，是机体发挥免疫效应不可或缺的效应细胞。NK细胞在外周血中的含量远不能满足临床需要，目前主要利用细胞因子的刺激来扩增NK细胞，但上述方法扩增的NK细胞与临床需求仍存在一定的差距。如何提供一种可扩增出大量且高活性的NK细胞的培养基，是NK细胞体外扩增领域亟待解决的问题之一。
技术实现思路
本专利技术主要解决的技术问题是提供一种NK细胞培养基及体外扩增NK细胞的方法，可扩增出数量大、活性高、杀伤性强的NK细胞。为解决上述技术问题，本专利技术提供一种NK细胞培养基，包括基础培养基和添加物，添加物各组分及浓度为：8-12g/L人血清白蛋白、2.5-7.5mmol/L尼克酰胺、0.5-2.0μmol/L来那度胺、8-16mmol/LHEPES。其中，基础培养基为MEM-alpha培养基。其中，添加物各组分及浓度为：9-11g/L人血清白蛋白、3.5-6.5mmol/L尼克酰胺、0.8-1.5μmol/L来那度胺、9-15mmol/LHEPES。其中，添加物各组分及浓度为：10g/L人血清白蛋白、5mmol/L尼克酰胺、1.0μmol/L来那度胺、10mmol/LHEPES。为解决上述技术问题，本专利技术提供一种体外扩增NK细胞的方法，包括以下步骤：将制备的NK细胞悬于NK细胞培养基中，并将悬有NK细胞的培养基转移至细胞培养瓶中，NK细胞的密度为4.5×106-5.5×106个/20ml；在细胞培养瓶中加入体积比为15%-25%的自体血浆及5-15μg/ml抗Her-2单克隆抗体、950-1050U/ml重组人IL-2、25-35ng/ml重组人IL-15、5-15ng/ml重组人IL-21，并将细胞培养瓶置于37℃、5%CO2的培养箱中培养；间隔预定时间补加NK细胞培养基及950-1050U/ml重组人IL-2、25-35ng/ml重组人IL-15、5-15ng/ml重组人IL-21，当培养体系为90-110ml时，将细胞悬液转移至细胞培养袋中培养；培养预定天数后，获得扩增的NK细胞；其中，NK细胞培养基包括基础培养基和添加物，添加物各组分及浓度为：8-12g/L人血清白蛋白、2.5-7.5mmol/L尼克酰胺、0.5-2.0μmol/L来那度胺、8-16mmol/LHEPES。其中，初始悬于NK细胞培养基中的NK细胞的密度为5×106个/20ml。其中，自体血浆的浓度为体积比20%，抗Her-2单克隆抗体的浓度为10μg/ml，重组人IL-2的浓度为1000U/ml，重组人IL-15的浓度为30ng/ml，重组人IL-21的浓度为10ng/ml。其中，基础培养基为MEM-alpha培养基。其中，添加物各组分及浓度为：10g/L人血清白蛋白、5mmol/L尼克酰胺、1.0μmol/L来那度胺、10mmol/LHEPES。其中，细胞培养袋为透气细胞培养袋。本专利技术的有益效果是：区别于现有技术的情况，本专利技术的NK细胞培养基包括基础培养基和添加物，基础培养基为MEM-alpha培养基，添加物各组分及浓度为：8-12g/L人血清白蛋白、2.5-7.5mmol/L尼克酰胺、0.5-2.0μmol/L来那度胺、8-16mmol/LHEPES。通过上述培养基体外扩增NK细胞，可扩增出数量大、活性高、杀伤性强的NK细胞。附图说明图1是本专利技术体外扩增的NK细胞流式结果图一；图2是本专利技术体外扩增的NK细胞流式结果图二。具体实施方式实施例1体外扩增NK细胞的方法如下：将制备的NK细胞悬于NK细胞培养基中，NK细胞的密度为5×106个/20ml，然后将悬有NK细胞的培养基转移至细胞培养瓶中；在细胞培养瓶中加入体积比为20%的自体血浆及10μg/ml抗Her-2单克隆抗体、1000U/ml重组人IL-2、30ng/ml重组人IL-15、10ng/ml重组人IL-21，然后将细胞培养瓶置于37℃、5%CO2的培养箱中培养；每隔3天补加NK细胞培养基及1000U/ml重组人IL-2、30ng/ml重组人IL-15、10ng/ml重组人IL-21，当培养体系为100ml时，将细胞悬液转移到1.9L细胞培养袋中继续培养；培养14天后，从培养袋中取出细胞，获得扩增的NK细胞。其中，细胞培养袋为透气细胞培养袋。在本实施例中，NK细胞培养基包括基础培养基和添加物，基础培养基为MEM-alpha培养基，添加物各组分及浓度为：10g/L人血清白蛋白、5mmol/L尼克酰胺、1.0μmol/L来那度胺、10mmol/LHEPES。在本实施例中，细胞培养瓶为T75培养瓶。请参阅图1，图1是本实施例体外扩增的NK细胞流式结果图，如图1所示，由于制备的NK细胞纯度没有100%，因此还存在其他细胞的扩增。图1分为4个象限：左上，CD（16+56）阳性、CD3阴性，此细胞即为NK细胞，占84.7%；右上，CD3阳性、CD（16+56）阳性，此细胞即为NKT细胞（既有T细胞表型，又有NK细胞表型），占10.8%；右下，CD3阳性、CD（16+56）阴性，此细胞即为T细胞，占4.27%；左下，杂细胞，占0.161%。由图1可以看出，本实施例的扩增效果非常可观。实施例2体外扩增NK细胞的方法如下：将制备的NK细胞悬于NK细胞培养基中，NK细胞的密度为5×106个/20ml，然后将悬有NK细胞的培养基转移至细胞培养瓶中；在细胞培养瓶中加入体积比为20%的自体血浆及10μg/ml抗Her-2单克隆抗体、1000U/ml重组人IL-2、30ng/ml重组人IL-15、10ng/ml重组人IL-21，然后将细胞培养瓶置于37℃、5%CO2的培养箱中培养；每隔3天补加NK细胞培养基及1000U/ml重组人IL-2、30ng/ml重组人IL-15、10ng/ml重组人IL-21，当培养体系为100ml时，将细胞悬液转移到1.9L细胞培养袋中继续培养；培养14天后，从培养袋中取出细胞，获得扩增的NK细胞。其中，细胞培养袋为透气细胞培养袋。在本实施例中，NK细胞培养基包括基础培养基和添加物，基础培养基为MEM-alpha培养基，添加物各组分及浓度为：11g/L人血清白蛋白、6mmol/L尼克酰胺、1.2μmol/L来那度胺、12mmol/LHEPES。在本实施例中，细胞培养瓶为T75培养瓶。请参阅图2，图2是本实施例体外扩增的NK细胞流式结果图，如图2所示，由于制备的NK细胞纯度没有100%，因此还存在其他细胞的扩增。图2分为4个象限：左上，CD（16+56）阳性、CD3阴性，此细胞即为NK细胞，占84.9%；右上，CD3阳性、CD（16+56）阳性，此细胞即为NKT细胞（既有T细胞表型，又有NK细胞表型），占10.9%；右下，CD3阳性、CD（16+56）阴性，此细胞即为T细胞，占4.05%；左下，杂细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种NK细胞培养基，其特征在于，包括基础培养基和添加物，所述添加物各组分及浓度为：8‑12g/L人血清白蛋白、2.5‑7.5mmol/L尼克酰胺、0.5‑2.0μmol/L来那度胺、8‑16mmol/L HEPES。

【技术特征摘要】
1.一种NK细胞培养基，其特征在于，包括基础培养基和添加物，所述添加物各组分及浓度为：8-12g/L人血清白蛋白、2.5-7.5mmol/L尼克酰胺、0.5-2.0μmol/L来那度胺、8-16mmol/LHEPES。2.根据权利要求1所述的NK细胞培养基，其特征在于，所述基础培养基为MEM-alpha培养基。3.根据权利要求2所述的NK细胞培养基，其特征在于，所述添加物各组分及浓度为：9-11g/L人血清白蛋白、3.5-6.5mmol/L尼克酰胺、0.8-1.5μmol/L来那度胺、9-15mmol/LHEPES。4.根据权利要求3所述的NK细胞培养基，其特征在于，所述添加物各组分及浓度为：10g/L人血清白蛋白、5mmol/L尼克酰胺、1.0μmol/L来那度胺、10mmol/LHEPES。5.一种体外扩增NK细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：将制备的NK细胞悬于NK细胞培养基中，并将悬有NK细胞的培养基转移至细胞培养瓶中，NK细胞的密度为4.5×106-5.5×106个/20ml；在所述细胞培养瓶中加入体积比为15%-25%的自体血浆及5-15μg/ml抗Her-2单克隆抗体、950-1050U/ml重组人IL-2、25-35ng/ml重组人IL-15、5-15ng/ml重组人IL-21，并将所述细胞培养瓶置于37℃、5%CO2的培养箱中培养；间隔预定时间补加所述NK细胞培养基及...

【专利技术属性】
技术研发人员：于志军，张希涛，韩艳萍，
申请(专利权)人：广州市鲁诚生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44