NK细胞体外扩增培养基组合和培养方法技术

本公开涉及一种NK细胞体外扩增培养基组合和培养方法，所述培养基组合，包括基础培养基、诱导培养基、增殖培养基和活化适应培养基；所述基础培养基的组成成分包括：RPMI‑1640培养基、GT‑T551培养基、庆大霉素和BSA；所述诱导培养基的组成成分包括：RPMI‑1640培养基、GT‑T551培养基、BSA、香菇多糖、灵芝多糖、茶多酚、大蒜素和紫杉醇；所述增殖培养基的组成成分包括：RPMI‑1640培养基、GT‑T551培养基、BSA、白细胞介素；所述活化适应培养基包括：RPMI‑1640培养基、GT‑T551培养基、胰岛素、转铁蛋白和谷氨酰胺。通过上述技术方案，利用本公开所提供的NK细胞体外扩增培养基组合和方法培养获得的NK细胞数量更多，在临床治疗中也具有更高的活性。

【技术实现步骤摘要】
NK细胞体外扩增培养基组合和培养方法
本公开涉及生物
，具体地，涉及一种NK细胞体外扩增培养基组合和培养方法。
技术介绍
自然杀伤细胞(naturalkillercell，NK)是机体重要的免疫细胞，主要分布于外周血中，能够参与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节的生理过程。现有研究表明，NK细胞是人体内抗癌活性最强的细胞，可以释放穿孔素在靶细胞表面形成穿孔，再通过颗粒酶进入靶细胞诱导靶细胞凋亡，同时可以分泌大量的细胞因子作用于靶细胞，还可以通过进一步激活其他种类免疫细胞攻击靶细胞，并可以表达诱导细胞凋亡的蛋白和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体，使靶细胞发生程序性凋亡。NK细胞免疫治疗在临床上已成为一种重要的治疗手段。但是其在外周血中的数量仅占淋巴细胞总量的5％左右，如何实现NK细胞体外扩增培养从而应用于治疗是关键的技术问题。现有的NK细胞体外扩增手段主要包括在培养基中添加动物血清、细胞因子或与其它细胞共同培养来刺激NK细胞的生长。但是动物血清成分较复杂，易给细胞培养带来不安全因素；细胞因子的添加不当容易引起NK细胞激活受体和抑制受体表达变化；同时，异体的细胞也往往存在医学上的不安全性和伦理问题。因此，有必要开发一种高效、安全的NK细胞体外扩增方法从而为NK细胞的临床治疗应用提供有力的技术保障。
技术实现思路
本公开的目的是提供一种NK细胞体外扩增培养基组合及体外扩增方法。为了实现上述目的，本公开提供一种NK细胞体外扩增培养基组合，包括基础培养基、诱导培养基、增殖培养基和活化适应培养基；其中，所述基础培养基的组成成分包括：RPMI-1640培养基、GT-T551培养基、庆大霉素和BSA；所述诱导培养基的组成成分包括：RPMI-1640培养基、GT-T551培养基、BSA、香菇多糖、灵芝多糖、茶多酚、大蒜素和紫杉醇；所述增殖培养基的组成成分包括：RPMI-1640培养基、GT-T551培养基、BSA和细胞介素；所述活化适应培养基包括：RPMI-1640培养基、GT-T551培养基、胰岛素、转铁蛋白和谷氨酰胺。可选地，所述白细胞介素为IL-12、IL-15、IL-18和IL-21中的至少一种。可选地，所述白细胞介素为IL-12、IL-15、IL-18和IL-21。可选地，所述基础培养基包括以下含量的各组分：庆大霉素50-90IU/mL、BSA100-300μg/mL、RPMI-1640培养基与GT-T551培养基的体积比为1：0.8-1.2。可选地，所述诱导培养基包括以下含量的各组分：BSA100-300μg/mL、香菇多糖50-80μg/mL、灵芝多糖50-80μg/mL、茶多酚20-40μg/mL、大蒜素20-40μg/mL、紫杉醇20-40μg/mL，RPMI-1640培养基与GT-T551培养基的体积比为1：1-1.4。可选地，所述增殖培养基包括以下含量的各组分：BSA100-300μg/mL、IL-125-15ng/mL、IL-155-15ng/mL、IL-185-15ng/mL和IL-215-15ng/mL，RPMI-1640培养基与GT-T551培养基的体积比为1：1.2-1.6。可选地，所述活化适应培养基包括以下含量的各组分：胰岛素1.5-3μg/mL、转铁蛋白2-3μg/mL、谷氨酰胺1-2mM，RPMI-1640培养基与GT-T551培养基的体积比为1：2-4。本公开的第二个方面还提供了一种NK细胞体外扩增培养方法，包括使用本公开的第一个方面所述的NK细胞体外扩增培养基组合，所述方法包括：基础培养：将分离的单个核细胞接种于基础培养基中培养1-2天获得基础培养细胞；诱导培养：将所述基础培养细胞接种于诱导培养基中培养2-4天获得诱导培养细胞；增殖培养：将所述诱导培养细胞接种于增殖培养基中培养4-7天获得增殖培养细胞；活化适应：将所述增殖培养细胞接种于活化适应培养基中培养0.5-1.5天。可选地，所述接种的细胞密度为4.5×105个/mL-5.5×105个/mL。可选地，所述基础培养阶段、诱导培养阶段、增殖培养阶段和活化适应阶段在免疫细胞体外扩增装置中进行，所述装置包括细胞培养袋1和承载所述细胞培养袋1的承载台3，该装置还包括容纳于所述细胞培养袋1中的磁性浮球2以及在悬挂于所述细胞培养袋1上方并且能够驱动所述磁性浮球2在所述细胞培养袋1中移动的磁性悬挂驱动器4，所述磁性悬挂驱动器4包括能够吸引所述磁性浮球2的磁体片41和能够悬挂且驱动所述磁体片41在所述细胞培养袋1上方移动的悬挂驱动架42；所述细胞培养袋(1)中充有细胞培养液，述细胞培养液中含有培养基以及待扩增的细胞；所述磁性浮球(2)在浮力和磁力的合力作用下漂浮在培养液液面上；所述磁体片(41)能够在所述细胞培养袋(1)上方往复移动，从而通过磁力的作用，驱动所述磁性浮球(2)在漂浮状态下在培养液液面往复移动，所述磁性浮球(2)在培养液液面以下的部分能够搅拌培养液，从而在所述细胞培养袋(1)中模拟血液流动的体内环境。通过上述技术方案，本公开所提供的NK细胞体外扩增培养基能够避免动物血清成分和异体细胞的添加，增加了细胞在临床应用中的安全性。而且采用含有不同组分的培养基在细胞生产的特定阶段进行有针对性的培养，可以更好的满足NK细胞在不同阶段的生长需求，更有效的扩增和活化NK细胞，培养获得的NK细胞数量更多在临床治疗中也具有更高的活性。本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明，附图说明附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：图1是本公开的免疫细胞体外扩增装置中一种可选的实施方式的切向示意图。图2是本公开的免疫细胞体外扩增装置中一种可选的实施方式的俯视示意图。图3是本公开的免疫细胞体外扩增装置中一种可选的实施方式的部件示意图。图4是实施例和对比例NK细胞扩增倍数结果示意图。图5是实施例和对比例培养的NK细胞纯度示意图。图6是实施例和对比例培养的NK细胞杀伤率结果示意图。附图标记说明1细胞培养袋2磁性浮球3承载台4磁性悬挂驱动器11进气口12出气口13进液口14出液口15人工瓣膜片31恒温托盘32底座41磁体片42悬挂驱动架43悬臂431限位孔432驱动孔4310限位杆4311支撑架4320丝杆4321电动机具体实施方式以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。本公开的第一个方面提供了一种NK细胞体外扩增培养基组合，包括基础培养基、诱导培养基、增殖培养基和活化适应培养基；其中，所述基础培养基的组成成分包括：RPMI-1640培养基、GT-T551培养基、庆大霉素和BSA；所述诱导培养基的组成成分包括：RPMI-1640培养基、GT-T551培养基、BSA、香菇多糖、灵芝多糖、茶多酚、大蒜素和紫杉醇；所述增殖培养基的组成成分包括：RPMI-1640培养基、GT-T551培养基、BSA和白细胞介素；所述活化适应培养基包括：RPMI-1640培养基、GT-T551培养基、胰岛素、转铁蛋白和谷氨酰胺。在本公开的具体实施过程中，根据细胞培养的不同阶段依次先本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种NK细胞体外扩增培养基组合，包括基础培养基、诱导培养基、增殖培养基和活化适应培养基；其中，所述基础培养基的组成成分包括：RPMI‑1640培养基、GT‑T551培养基、庆大霉素和BSA；所述诱导培养基的组成成分包括：RPMI‑1640培养基、GT‑T551培养基、BSA、香菇多糖、灵芝多糖、茶多酚、大蒜素和紫杉醇；所述增殖培养基的组成成分包括：RPMI‑1640培养基、GT‑T551培养基、BSA和白细胞介素；所述活化适应培养基包括：RPMI‑1640培养基、GT‑T551培养基、胰岛素、转铁蛋白和谷氨酰胺。

【技术特征摘要】
1.一种NK细胞体外扩增培养基组合，包括基础培养基、诱导培养基、增殖培养基和活化适应培养基；其中，所述基础培养基的组成成分包括：RPMI-1640培养基、GT-T551培养基、庆大霉素和BSA；所述诱导培养基的组成成分包括：RPMI-1640培养基、GT-T551培养基、BSA、香菇多糖、灵芝多糖、茶多酚、大蒜素和紫杉醇；所述增殖培养基的组成成分包括：RPMI-1640培养基、GT-T551培养基、BSA和白细胞介素；所述活化适应培养基包括：RPMI-1640培养基、GT-T551培养基、胰岛素、转铁蛋白和谷氨酰胺。2.根据权利要求1所述的培养基组合，其特征在于，所述白细胞介素为IL-12、IL-15、IL-18和IL-21中的至少一种。3.根据权利要求2所述的培养基组合，其特征在于，所述白细胞介素为IL-12、IL-15、IL-18和IL-21。4.根据权利要求1-3中任意一项所述的培养基组合，其特征在于，所述基础培养基包括以下含量的各组分：庆大霉素50-90IU/mL、BSA100-300μg/mL、RPMI-1640培养基与GT-T551培养基的体积比为1：0.8-1.2。5.根据权利要求1-3中任意一项所述的培养基组合，其特征在于，所述诱导培养基包括以下含量的各组分：BSA100-300μg/mL、香菇多糖50-80μg/mL、灵芝多糖50-80μg/mL、茶多酚20-40μg/mL、大蒜素20-40μg/mL、紫杉醇20-40μg/mL，RPMI-1640培养基与GT-T551培养基的体积比为1：1-1.4。6.根据权利要求1-3中任意一项所述的培养基组合，其特征在于，所述增殖培养基包括以下含量的各组分：BSA100-300μg/mL、IL-125-15ng/mL、IL-155-15ng/mL、IL-185-15ng/mL和IL-215-15ng/mL，RPMI-1640培养基与GT-T551培养基的体积比为1：1.2-1.6。7.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭天欢，杨小芳，何淑婷，
申请(专利权)人：浙江丹晖生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33