一种体外高效扩增NK细胞的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种体外高效扩增NK细胞的方法及其应用，解决了传统地方法扩增的NK细胞表现出低扩增倍数、细胞因子依赖性、细胞衰老等问题，其技术方案要点是如下步骤：Step1.通过传统的Ficoll‑Paque密度梯度离心法从人的外周血中分离出PBMC；Step2.将人工抗原递呈细胞经100Grays辐照处理后，液氮冻存；Step3.将PBMC与辐照处理后的人工抗原递呈细胞按质量比为1:2的比例在添加有50IU/mL白介素2的RPMI 1640培养基的T75的细胞培养瓶内共培养，每2‑3天更换新鲜培养基；Step4.每隔7天，计算T75的细胞培养瓶内的总细胞数目，添加等细胞数目的辐照处理后的人工抗原递呈细胞再次刺激，连续培养21天，得到扩增后的NK细胞，得到了获得大量高纯度高质量NK细胞的方法。

Method for in vitro high-efficiency amplification of NK cell and application thereof

The invention discloses a method for efficient amplification of NK cells in vitro and its application, to solve the traditional NK cell expansion methods showed low expansion, cytokine dependent cell senescence, and other issues, the technical proposal is as follows: Step1. Ficoll by Paque density gradient centrifugation of PBMC isolated from traditional human peripheral blood; Step2. artificial antigen presenting cells irradiated with 100Grays after cryopreservation; Step3. artificial antigen PBMC and irradiated cells presenting according to the mass ratio of 1:2 in the proportion of adding 50IU/mL interleukin 2 RPMI T75 1640 medium cell culture bottle co culture, every 2 days to replace the 3 fresh medium every 7 days; Step4., calculate the T75 total number of cell cell culture bottle, artificial antigen of irradiation add cell number after presenting cells again After 21 days of continuous stimulation, the amplified NK cells were obtained, and a large number of highly purified and high-quality NK cells were obtained.

【技术实现步骤摘要】
一种体外高效扩增NK细胞的方法及其应用
本专利技术涉及细胞培养和免疫治疗领域，特别涉及一种体外高效扩增NK细胞的方法及其应用。
技术介绍
自然杀伤细胞由造血干细胞分化发育而来，属于人体免疫细胞的一种，是具有细胞溶解作用、能够分泌免疫调节因子的效应淋巴细胞，医学上称之为“人体抗肿瘤和抗感染的第一道防线”。与T淋巴细胞和B淋巴细胞不同，NK细胞无须预先接触抗原即可杀伤靶细胞(包括细菌、病毒感染的宿主细胞和肿瘤细胞)，且其杀伤效应无MHC限制性，这种特性使得NK细胞在抗肿瘤反应和免疫监视病变细胞、癌变细胞过程中发挥着巨大的作用。大量临床实验数据表明，NK细胞治疗在骨肉瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌和乳腺癌等癌症治疗中，起到了非常积极的治疗效果。然而，如何在体外获得大量高纯度高质量的NK细胞一直限制着NK细胞免疫治疗在临床上的广泛应用。在健康人的外周血中，NK细胞大约占外周血淋巴细胞的5％-10％。传统地，通过磁珠去除外周血淋巴细胞中的T淋巴细胞，再用高剂量的细胞因子如高剂量的白介素2或饲养层细胞刺激NK细胞的方法所获得的NK细胞表现出低扩增倍数、细胞因子依赖性、细胞衰老等本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种体外高效扩增NK细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：Step1.通过传统的Ficoll‑Paque密度梯度离心法从人的外周血中分离出PBMC；Step2.将人工抗原递呈细胞经辐照处理后，液氮冻存；Step3.将PBMC与辐照处理后的人工抗原递呈细胞按质量比为1:2的比例在添加有白介素2的RPMI 1640培养基的T75的细胞培养瓶内共培养，每2‑3天更换新鲜培养基；Step4.每隔7天，计算T75的细胞培养瓶内的总细胞数目，添加等细胞数目的辐照处理后的人工抗原递呈细胞再次刺激，连续培养21天，得到扩增后的NK细胞。

【技术特征摘要】
1.一种体外高效扩增NK细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：Step1.通过传统的Ficoll-Paque密度梯度离心法从人的外周血中分离出PBMC；Step2.将人工抗原递呈细胞经辐照处理后，液氮冻存；Step3.将PBMC与辐照处理后的人工抗原递呈细胞按质量比为1:2的比例在添加有白介素2的RPMI1640培养基的T75的细胞培养瓶内共培养，每2-3天更换新鲜培养基；Step4.每隔7天，计算T75的细胞培养瓶内的总细胞数目，添加等细胞数目的辐照处理后的人工抗原递呈细胞再次刺激，连续培养21天，得到扩增后的NK细胞。2.根据权利要求1所述的一种体外高效扩增NK细胞的方法，其特征在于，所述人工抗原递呈细胞为K562-mb.IL21＋CD137L细胞株，其包括稳定表达细胞膜结合型的白介素21和CD137配体的K562细胞株。3.根据权利要求2所述的一种体外高效扩增NK细胞的方法，其特征在于，所述细胞膜结合型的白介素21为白介素21与跨膜蛋白或铰链蛋白相连而成的融合蛋白，其结构由GM-CSFsignalpeptide、白介素21、IgG4和CD4相连而形成。4.根据权利要求2所述的一种体外高效扩增NK细胞的方法，其特征在于，所述辐照处理的辐照强度为80~150Grays。5.根据权利要求2所述的一种体外高效扩增NK细胞的方法，其特征在于，所述白介素2的剂量为...

【专利技术属性】
技术研发人员：马宜冬，
申请(专利权)人：宁波枫林生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33