一种造血干细胞体外扩增培养的无血清培养基及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种造血干细胞体外扩增培养的无血清培养基及其制备方法。本发明专利技术的体外扩增造血干细胞的培养基不引入外源性基因表达，不改变原干细胞的基因组稳定性，无致瘤风险，且不涉及饲养层细胞等外源性细胞混杂而导致的干细胞移植安全问题，并通过联合应用多种细胞因子，选择适宜的培养条件及扩增时间，克服了扩增数量不足的缺点，有效地扩增其数量，同时保持其质量，即达到保留HSC并扩增早期造血祖细胞来维持造血重建能力的作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于细胞生物学、分子生物学和医学领域的研究领域，涉及一种造血干细胞体外扩增培养的无血清培养基，更具体地说，涉及用于造血干细胞体外扩增培养的无血清培养基及其应用。
技术介绍
造血干细胞(hematopoieticstemcell，HSC)是指体内尚未发育成熟并且负责生成所有各系血细胞的最原始的细胞群。HSC是多功能干细胞，医学上称其为“万能细胞”。造血干细胞有高度自我更新能力和多种分化潜能，可产生所有成熟的血细胞，如红细胞、白细胞、血小板和淋巴细胞等。HSC是一种不均一、不成熟造血前体细胞，在生命过程中能重建整个造血系统，具有向B细胞和粒细胞两种途径分化，并且有维持长期造血的功能。近年来，HSC越来越多地被应用于临床治疗血液系统恶性肿瘤、实体瘤、骨髓衰竭性疾病及一些先天性疾病等，在儿科的血液病、肿瘤、遗传病的治疗中也表现出一定的应用前景。临床发现HSCT时造血干细胞的数量与移植后造血和免疫功能的重建有密切关系，并且大剂量的造血干细胞的输注利于供者造血干细胞在受体内的植入。所以在HSC用于治疗时，也面临着一个严峻的问题：没有足够多的HSC用于移植。HSC进行体外扩增培养是一个很好的解决方法，同时也是一项极具挑战的技术，基于以下几种原因：①HSC的体外扩增要求保持持续的自我更新能力的同时，也在扩增中阻止其分化；但是，关于调节HSC的自我更新和阻止HSC扩增的生理学机制的认识有限；②扩增干细胞的数量与移植的成功率密切相关。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种用于培养细胞的无血清培养基。本专利技术提供的用于培养细胞的无血清培养基包括重组人胰岛素、重组人转铁蛋白、重组人血白蛋白、β-巯基乙醇、乙醇胺、胆固醇、亚油酸和油酸。上述无血清培养基中，所述重组人胰岛素、所述重组人转铁蛋白和所述重组人血白蛋白均指能通过基因工程手段进行体外表达得到的，是能够重复人工制备的。上述无血清培养基中，所述重组人胰岛素、所述重组人转铁蛋白、所述重组人血白蛋白、所述β-巯基乙醇、所述乙醇胺、所述胆固醇、所述亚油酸和所述油酸的质量比为5-30：20-80：50-300：10-100：1-10：1-10：0.1-5：1.5。上述无血清培养基中，所述重组人胰岛素、所述重组人转铁蛋白、所述重组人血白蛋白、所述β-巯基乙醇、所述乙醇胺、所述胆固醇、所述亚油酸和所述油酸的质量比为10:50:100:40:5:5:1:1.5。上述无血清培养基中，所述培养基还包括基础培养基、L-谷氨酰胺、干细胞因子、白细胞介素3、白细胞介素6、血小板生成素、促红细胞生成素、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和粒细胞集落刺激因子；所述基础培养基为细胞基础培养基；所述细胞基础培养基具体为IMDM基础培养基。所述培养基由所述IMDM基础培养基、所述重组人胰岛素、所述重组人转铁蛋白、所述重组人血白蛋白、所述β-巯基乙醇、所述乙醇胺、所述胆固醇、所述亚油酸、所述油酸、所述L-谷氨酰胺、所述干细胞因子、所述白细胞介素3、所述白细胞介素6、所述血小板生成素、所述促红细胞生成素、所述粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和所述粒细胞集落刺激因子组成。其中，所述L-谷氨酰胺在细胞临培养前加入；所述干细胞因子、所述白细胞介素3、所述白细胞介素6、所述血小板生成素、所述促红细胞生成素、所述粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和所述粒细胞集落刺激因子均在细胞培养的过程中加入。上述无血清培养基中，所述培养基的pH为6.8-7.2。上述无血清培养基中，所述重组人胰岛素在所述无血清培养基中的浓度为5-30mg/L；所述重组人转铁蛋白在所述无血清培养基中的浓度为20-80mg/L；所述重组人血白蛋白在所述无血清培养基中的浓度为50-300mg/L所述β-巯基乙醇在所述无血清培养基中的浓度为10-100mg/L；所述乙醇胺在所述无血清培养基中的浓度为1-10mg/L；所述胆固醇在所述无血清培养基中的浓度为1-10mg/L；所述亚油酸在所述无血清培养基中的浓度为0.1-5mg/L；所述油酸在所述无血清培养基中的浓度为0.1-5mg/L；所述L-谷氨酰胺在所述无血清培养基中的浓度为100-800mg/L所述干细胞因子在所述无血清培养基中的浓度为10-100ng/mL；所述白细胞介素3在所述无血清培养基中的浓度为10-100ng/mL；所述白细胞介素6在所述无血清培养基中的浓度为10-100ng/mL；所述血小板生成素在所述无血清培养基中的浓度为1-10U/ml；所述促红细胞生成素在所述无血清培养基中的浓度为1-10U/ml；所述粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子在所述无血清培养基中的浓度为10-50ng/ml；所述粒细胞集落刺激因子在所述无血清培养基中的浓度为10-50ng/ml。上述无血清培养基中，所述重组人胰岛素在所述无血清培养基中的浓度为10mg/L；所述重组人转铁蛋白在所述无血清培养基中的浓度为50mg/L；所述重组人血白蛋白在所述无血清培养基中的浓度为100mg/L；所述β-巯基乙醇在所述无血清培养基中的浓度为40mg/L；所述乙醇胺在所述无血清培养基中的浓度为5mg/L；所述胆固醇在所述无血清培养基中的浓度为5mg/L；所述亚油酸在所述无血清培养基中的浓度为1mg/L；所述油酸在所述无血清培养基中的浓度为1.5mg/L；所述L-谷氨酰胺在所述无血清培养基中的浓度为584mg/L；所述干细胞因子在所述无血清培养基中的浓度为50ng/mL；所述白细胞介素3在所述无血清培养基中的浓度为20ng/mL；所述白细胞介素6在所述无血清培养基中的浓度为20ng/mL；所述血小板生成素在所述无血清培养基中的浓度为4U/ml；所述促红细胞生成素在所述无血清培养基中的浓度为3U/ml；所述粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子在所述无血清培养基中的浓度为14ng/ml；所述粒细胞集落刺激因子在所述无血清培养基中的浓度为20ng/ml。本专利技术的无血清培养基在具体的使用中，先将1000mlIMDM基础培养液(Gibco31980030)、重组人胰岛素(大肠杆菌重组表达，LIFE公司)、重组人转铁蛋白(酵母重组表达，Invitria公司)、重组人血白蛋白(Invitria公司，Cellastim)、β-巯基乙醇(Invitrogen，21985-023)、乙醇胺(Sigma,E0135)、胆固醇(Sig本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于培养细胞的无血清培养基，所述培养基包括重组人胰岛素、重组人转铁蛋白、重组人血白蛋白、β‑巯基乙醇、乙醇胺、胆固醇、亚油酸和油酸。

【技术特征摘要】
1.一种用于培养细胞的无血清培养基，所述培养基包括重组人胰岛素、重组人
转铁蛋白、重组人血白蛋白、β-巯基乙醇、乙醇胺、胆固醇、亚油酸和油酸。
2.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于：
所述重组人胰岛素、所述重组人转铁蛋白、所述重组人血白蛋白、所述β-巯基乙
醇、所述乙醇胺、所述胆固醇、所述亚油酸和所述油酸的质量比为5-30：20-80：50-300：
10-100：1-10：1-10：0.1-5：1.5。
3.根据权利要求1或2所述的无血清培养基，其特征在于：所述重组人胰岛素、
所述重组人转铁蛋白、所述重组人血白蛋白、所述β-巯基乙醇、所述乙醇胺、所述胆
固醇、所述亚油酸和所述油酸的质量比为10:50:100:40:5:5:1:1.5。
4.根据权利要求1-3中任一所述的无血清培养基，其特征在于：
所述培养基还包括基础培养基、L-谷氨酰胺、干细胞因子、白细胞介素3、白细
胞介素6、血小板生成素、促红细胞生成素、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和粒细胞
集落刺激因子；
所述L-谷氨酰胺在细胞临培养前加入；
所述干细胞因子、所述白细胞介素3、所述白细胞介素6、所述血小板生成素、
所述促红细胞生成素、所述粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和所述粒细胞集落刺激因子
均在细胞培养的过程中加入。
5.根据权利要求1-4中任一所述的无血清培养基，其特征在于：
所述培养基的pH为6.8-7.2；
所述基础培养基为细胞基础培养基；所述细胞基础培养基具体为IMDM基础培养
基。
6.根据权利要求1-5中任一所述的无血清培养基，其特征在于：
所述重组人胰岛素在所述无血清培养基中的浓度为5-30mg/L；
所述重组人转铁蛋白在所述无血清培养基中的浓度为20-80mg/L；
所述重组人血白蛋白在所述无血清培养基中的浓度为50-300mg/L
所述β-巯基乙醇在所述无血清培养基中的浓度为10-100mg/L；
所述乙醇胺在所述无血清培养基中的浓度为1-10mg/L；
所述胆固醇在所述无血清培养基中的浓度为1-10mg/L；
所述亚油酸在所述无血清培养基中的浓度为0.1-5mg/L；
所述油酸在所述无血清培养基中的浓度为0.1-5mg/L；
所述L-谷氨酰胺在所述无血清...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔志平，单磊，
申请(专利权)人：广东艾时代生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：广东;44