本发明专利技术公开了一种用于脐带血造血干细胞扩增的培养体系及其应用，包括AIM-V培养基、血小板裂解液PL、干细胞因子SCF、人FMS样酪氨酸激酶3配体Flt-3L、G-CSF、IL-3，还添加了血管生成素样蛋白Angiopoietin-like protein 3(ANGPTL3)、小分子化合物StemRegenin(SR1)和嘧啶吲哚分子UM171。加入适当浓度的ANGPTL3和SR1、UM171组合能够使造血干细胞群体的数量大大增加，为脐带造血干细胞的生长、扩增，更为重要的是能够显著提高造血干细胞在移植到受体体内后的植入能力和造血系统重建能力，从而为脐血干细胞在临床上的应用开辟了新的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种用于脐带血造血干细胞扩增的培养体系及其应用。
技术介绍
造血干细胞移植是治疗白血病和淋巴瘤等恶性肿瘤、代谢性疾病、自身免疫性疾病及先天免疫缺陷等严重危害人类健康疾病的最有效治疗方法之一。骨髓中造血干细胞(HSC)数量较低，移植后难以在患者体内有效进行造血重建，这也成为HSC临床应用的一个瓶颈，而且约有30-40％的患者由于找不到相同HLA配型的供者而失去了治疗的机会，脐带血(umbilicalcordblood，UCB)是除骨髓和外周血干细胞外的另一种重要造血干细胞来源，它的优点是采集不影响供者、受巨细胞病毒(CMV)和EB病毒污染机会小、移植后急慢性移植物抗宿主病(GVHD)发生率低于成年供者的骨髓移植、可以建立脐带血库，随时提供移植所需要的HLA相合的干细胞。尽管UCB具有诸多优点。但是由于一份脐带血所含的细胞数有限，这大大限制了其在临床的广泛应用。体外扩增是解决UCB这一缺陷的重要方法，因而优化UCB造血干/祖细胞(HSPCs)的体外扩增方案极为迫切。
技术实现思路
基于上述原因，申请人为克服现有技术的不足，提供一种更好地提高造血干细胞在体外的生长速度和扩增效率以及CD34+CD45RA-、CD34+LKS、CD34-LKS的比例的培养体系。本专利技术所要解决的技术问题是，提供一种通过在体外培养脐带血细胞的体系中加入不同的细胞因子和小分子化合物，从而能够更好地提高造血干细胞在体外的生长速度和扩增效率以及CD34+CD45RA-、CD34+LKS、CD34-LKS的比例。本专利技术通过下述技术方案实现的。一种用于脐带血造血干细胞扩增的培养体系，该培养体系包括AIM-V培养基、SCF、Flt-3L，G-CSF，IL-3，StemRegenin(SR1)，UM171，血小板裂解液。其特征在于各种细胞因子的组合和小分子化合物的联合应用。所述的用于脐带血造血干细胞扩增的培养体系，各组分的含量如下：所述血小板裂解液的制备过程：采集的脐带血40～150ml以2:1比例缓慢加入盛有淋巴分离液的50ml离心管中，在4～25度温度下，1500-3000rpm，离心10-20min，上层为富含血小板血浆，采血袋或采血管中采用肝素作抗凝剂，上层的血清占总体积的45～50％。富含血小板的血浆放置于-80度超低温冰箱冻存，12-24h后迅速取出放置25-37度水浴中复苏，如此反复2-5次。于4-25度以2000～5000rpm离心10-30min，取上清液，0.22μm过滤，以0.2-0.5％的浓度添加到脐带血造血干细胞扩增体系中。其中化合物SR1和UM171的组合，浓度分别为100-1000nM和10-100nM。所述的用于脐带血造血干细胞扩增的培养体系，其中Angiopoietin-likeprotein3的添加，浓度为30-200ng/mL。SCF是一种作用于最早期造血干/祖细胞的造血细胞因子，在维持造血细胞存活，促进造血细胞增殖和分化，调控各系造血细胞的生长发育中起着重要作用，而其它造血细胞因子如G-CSF、Flt-3L等都是作用于较晚期或晚期定向增殖分化的细胞。SCF单独作用刺激造血细胞增殖和促进克隆形成能力都微弱，而与其它细胞因子有明显协同促进造血功能等作用。1993年Hood等首先提出富血小板血浆，并发现富血小板血浆含丰富的血小板，其数目比全血高3倍以上。血小板中含有大量的生长因子，如血小板衍生生长因子PDGF-AB，转化生长因子βTGF-β，类胰岛素生长因子IGF，表皮生长因子EGF，血管内皮生长因子VEGF等，分泌后可促进细胞的分裂和增殖、增加胶原的合成、激发血管长入和诱导细胞分化，本专利技术采用血小板裂解液培养造血干细胞，不仅为造血干细胞的生长提供了生长环境，降低了培养体系中所需细胞因子的用量，也降低了使用FBS给临床应用带来的风险。嘌呤衍生物StemRegenin(SR1)化合物被认为可在体外促进HSPC扩增。在体外培养人脐带血来源CD34+细胞时加入SRl及细胞因子SCF、TPO、Flt3L、IL-6共培养5周后，与相应对照组相比，CD34+细胞增加了47倍，相同条件下培养人外周血来源CD34+细胞3周即可使CD34+细胞增加73倍。而一旦去除了SRl后，细胞则迅速发生分化。通过集落形成实验表明，加入SRl培养后可显著提高各系细胞集落形成单位(CFU)形成。另外，值得注意的是，SR1仅对人、猴、狗来源的HSPC发挥作用，而对小鼠来源HSPC无扩增作用，提示SRl的作用机制可能存在种属特异性。将用这种方法扩增的CD34+细胞植人免疫缺鼠体内，发现NOD-SCID重建细胞(SRC)增加了17倍，并且均可保持多系细胞长期重建能力。这也是现有小分子化合物中体外扩增HSPC效果最为显著的小分子化合物。近期研究表明，SR1可抑制细胞色素P4501B1(CYP1B1)和香烃受体抑制物(AHRR)的表达，两者在转录水平均受到芳香烃受体(AhR)的调节，证明SR1可能作为一种拮抗剂作用于AhR信号通路。芳烃受体(AhR)拮抗剂和配体兴奋剂可促进人脐带血细胞体外扩增，这些细胞移植入免疫缺陷型小鼠体内后，小鼠的重建造血能力可维持16周。SR1的分子结构式：与嘌呤衍生物类似，研究发现了一个化学相关的小分子家族嘧啶吲哚分子UM171，它们可以在免疫缺陷型小鼠体内扩增造血干细胞，并维持重建造血功能长达6个月，此化合物可独立抑制芳烃受体，从而更大限度地是造血干细胞发挥再生潜能。嘧啶吲哚UM171的分子结构式如下：造血干祖细胞可细分为免疫表型为CD34-LKS的长期造血重建的干细胞(LT-HSC)、免疫表型为CD34+LKS的短期造血重建的干细胞(ST-HSC)和免疫表型为LKS-的祖细胞。HSC不表达各系特异性抗原Lin，包括B-G-M-T等(B细胞分化抗原B220、粒细胞分化抗原Gr-1、单核细胞分化抗原Mac-1、T细胞分化抗原CD4和CD8)，但高水平表达Sca-1和C-kit，简称LKS(Lin-Sca-1+-C-kit+)。HSC功能在移植模型中可以得到证实，CD34-LKS在经照射处理的小鼠体内能重建长期造血，具备干细胞自我更新的特性，其自我更新能力可保持于整个生命过程。CD34+LKS在造血发育过程中更成熟，自我更新能力只能维持约数周的时间。因此，在维护和扩增长期造血干细胞(LT-HSCs)时，大量扩增此种祖细胞具有很好的发展前景。不幸的是，多数扩增系统提供的数据显示，以长期造血干细胞(LT-HSCs)的丢失来获取祖细胞的扩增，这样就增加了晚期移植失败的风险。血管生成素样蛋白(ANGPTL)是近年来发现的一类新的分泌性糖蛋白。虽然ANGPTL与血管生成素(Ang)在组成上具有一定的同源性，也具有相似的结构域，但在功能上与Ang又有明显的不同。已有大量研究数据证实，在Sca-1+CD45+造血干细胞体外培养过程中，血管生成素样蛋白Angptl3的添加，不仅能够显著刺激长期再生造血干细胞(LT-HSC)的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于脐带血造血干细胞扩增的培养体系，其特征在于该培养体系包括AIM‑V培养基、SCF、Flt‑3L，G‑CSF，IL‑3，StemRegenin(SR1)，UM171，血小板裂解液。
【技术特征摘要】
1.一种用于脐带血造血干细胞扩增的培养体系，其特征在于该培养体系包括AIM-V培养基、SCF、Flt-3L，G-CSF，IL-3，StemRegenin(SR1)，UM171，血小板裂解液。
2.根据权利要求1所述的用于脐带血造血干细胞扩增的培养体系，其特征在于各种细胞因子的组合和小分子化合物的联合应用。
3.根据权利要求1所述的用于脐带血造血干细胞扩增的培养体系，其特征在于，各组分的含量如下：
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4.根据权利要求1所述的用于脐带血造血干细胞扩增的培养体系，其特征在于血小板裂解液的制备过程：采集的脐带血40～150ml以2:1比例缓慢加入盛有淋巴分离液的50ml离心管中，在4～25度温度下，1500-3000rpm，离心10-20min，上层为富含...
【专利技术属性】
技术研发人员：张云，李相国，高畅，孙丽娟，王冠华，
申请(专利权)人：顺昊细胞生物技术天津股份有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12
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