双靶向GPC3和ASGPR1的转基因免疫效应细胞及其应用制造技术

本发明专利技术涉及双靶向GPC3和ASGPR1的转基因免疫效应细胞及其应用。首次揭示了一种能同时识别GPC3和ASGPR1的基因修饰的免疫效应细胞，其可应用于GPC3和ASGPR1双阳性肿瘤如肝癌的治疗。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及肿瘤免疫治疗领域，更具体地，本专利技术涉及双靶向GPC3和ASGPR1的转基因免疫效应细胞及其应用。
技术介绍
T淋巴细胞在肿瘤免疫应答中的作用日益受到重视。基于T淋巴细胞的过继性免疫治疗在部分肿瘤中取得了一定的效果，并且该种免疫治疗方法可以克服抗体治疗的上述缺陷，但在大多数肿瘤的疗效仍不能令人满意。近年来，根据CTL对靶细胞的识别特异性依赖于T淋巴细胞受体(TCellReceptor，TCR)的发现，将针对肿瘤细胞相关抗原的抗体的scFv与T淋巴细胞受体的CD3ζ或FcεRIγ等胞内信号激活基序融合成嵌合抗原受体(Chimericantigenreceptor，CAR)，并将其通过如慢病毒感染等方式基因修饰在T淋巴细胞表面。这种CART淋巴细胞能够以主要组织相容性复合物(MajorHistocompatibilityComplex，MHC)非限制性方式选择性地将T淋巴细胞定向到肿瘤细胞并特异性地杀伤肿瘤。CART淋巴细胞是肿瘤免疫治疗领域的一个新的免疫治疗策略。嵌合抗原受体(CAR)包括胞外结合区，跨膜区和胞内信号区。通常胞外区包含能够识别肿瘤相关抗原的scFv，跨膜区采用CD8，CD28等分子的跨膜区，胞内信号区采用免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)CD3ζ或FcεRIγ及共刺激信号分子CD28、CD137、CD134等的胞内信号区。胞内信号区仅包含ITAM的为第一代CART淋巴细胞，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：scFv-TM-ITAM。该种CART可以激发抗肿瘤的细胞毒性效应，但是细胞因子分泌比较少，并且在体内不能激发持久的抗肿瘤效应[ZhangT.etal.ChimericNKG2D-modifiedTcellsinhibitsystemicT-celllymphomagrowthinamannerinvolvingmultiplecytokinesandcytotoxicpathways，CanRes2007，67(22):11029–11036.]。随后发展的第二代CART淋巴细胞加入了CD28或CD137(又名4-1BB)的胞内信号区，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：scFv-TM-CD28-ITAM或scFv-TM-CD137-ITAM。胞内信号区发生的B7/CD28或4-1BBL/CD137共刺激作用引起T淋巴细胞的持续增殖，并能够提高T淋巴细胞分泌IL-2和IFN-γ等细胞因子的水平，同时提高CART在体内的存活周期和抗肿瘤效果[DottiG.etal.CD28costimulationimprovesexpansionandpersistenceofchimericantigenreceptormodifiedTcellsinlymphomapatients.JClinInvest，2011，121(5):1822-1826.]。近些年发展的第三代CART淋巴细胞，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：scFv-TM-CD28-CD137-ITAM或scFv-TM-CD28-CD134-ITAM，进一步提高了CART在体内的存活周期和其抗肿瘤效果[CarpenitoC.，etal.ControloflargeestablishedtumorxenograftswithgeneticallyretargetedhumanTcellscontainingCD28andCD137domains.PNAS，2009，106(9):3360–3365.]。尽管CART淋巴细胞在肿瘤免疫治疗中具有诱人的前景，但一些潜在的风险亦需要考虑。比如，由于某些/种正常组织低表达CAR所能识别的特异性抗原可能造成CART淋巴细胞对表达相应抗原的正常组织的损伤。如，针对肾细胞癌患者肿瘤细胞上表达的抗原碳酸酐酶IX(CAIX)是第一个用于临床的CART淋巴细胞过继治疗的案例，也是第一个报道含CAR细胞的脱靶效应的案例。病人在多次输入CART淋巴细胞后出现2-4级肝毒性。分析原因为肝胆管上皮细胞低表达CAIX，原临床试验被迫中断同时排除了病人治疗效果的任何评价[StoterG.etal.TreatmentofmetastaticrenalcellcarcinomawithautologousT-lymphocytesgeneticallyretargetedagainstcarbonicanhydraseIX:firstclinicalexperience.Jclinoncol，2006，24(13):e20-e22.；NgoMC.，etal.Exvivogenetransferforimprovedadoptiveimmunotherapyofcancer.HumanMolecularGenetics，2011，R1–R7]。另外，CAR中过多的共刺激信号会降低效应细胞激活所需的阈值，使得基因修饰的T淋巴细胞在低水平抗原或没有抗原触发的条件下也可能会被活化，导致大量细胞因子的释放以致可能引发所谓的“细胞因子风暴”。这种信号外漏(singnalleakage)会导致脱靶细胞毒性，从而产生非特异性的组织损伤。例如，在采用针对Her2的第三代CAR临床治疗一个具有肝和肺转移的晚期结肠癌患者的过程中由于正常肺组织中低表达Her2而引发所谓的“细胞因子风暴”致病人猝死[MorganRA.，etal.ReportofaseriousadverseeventfollowingtheadministrationofTcellstransducedwithachimericantigenreceptorrecognizingErbb2.MolecularTherapy，2010，18(4):843–851.]。因此，本领域迫切需要研究化解CART细胞疗效低及存在潜在风险的问题的方法，开发出更有效杀伤肿瘤细胞的方法。磷脂酰肌醇蛋白多糖-3(Glypican-3，GPC3，又称DGSX，GTR2-2，MXR7，OCI-5，SDYS，SGB，SGBS或SGBS1)是一种细胞表面蛋白，属于硫酸乙酰肝素蛋白多糖家族。GPC3基因编码产生70-kDa左右的前体核心蛋白，该前体蛋白能够被弗林蛋白酶(furin)剪切产生40-kDa左右的可溶性的能够进入血液的氨基端(N末端)肽和30-kDa左右含有2个硫酸乙酰肝素(HS)糖链的膜结合的羧基端(C末端)肽。GPC3蛋白通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚依附在细胞膜上。GPC3高度表达于胎儿肝脏，而不表达于正常成年人的肝组织，但在肝细胞肝癌中恢复表达，与肝本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种双靶向的嵌合抗原受体免疫效应细胞，其特征在于，该细胞表达如下嵌合受体：特异性识别GPC3的嵌合抗原受体；和特异性识别ASGPR1的嵌合抗原受体。

【技术特征摘要】
1.一种双靶向的嵌合抗原受体免疫效应细胞，其特征在于，该细胞表达如下嵌
合受体：
特异性识别GPC3的嵌合抗原受体；和
特异性识别ASGPR1的嵌合抗原受体。
2.如权利要求1所述的嵌合抗原受体免疫效应细胞，其特征在于，所述的特异
性识别GPC3的嵌合抗原受体包括：抗GPC3的单链抗体，T细胞刺激信号分子。
3.如权利要求2所述的嵌合抗原受体免疫效应细胞，其特征在于，所述的T
细胞刺激信号分子选自：CD3ζ或FcεRIγ；更佳地，所述的特异性识别GPC3的嵌合
抗原受体包括：抗GPC3的单链抗体，CD8跨膜区，CD3ζ。
4.如权利要求1所述的嵌合抗原受体免疫效应细胞，其特征在于，所述的特异
性识别ASGPR1的嵌合抗原受体包括：抗ASGPR1的单链抗体，T细胞激活的共刺
激信号分子。
5.如权利要求4所述的嵌合抗原受体免疫效应细胞，其特征在于，所述的T
细胞激活的共刺激信号分子选自：CD27，CD28，CD137，CD134，ICOS蛋白的胞内
信号区，或其组合；更佳地，所述的特异性识别ASGPR1的嵌合抗原受体包括：抗
ASGPR1的单链抗体，CD28分子的跨膜区，CD28分子的胞内信号区和CD137胞内
信号区。
6.如权利要求1所述的嵌合抗原受体免疫效应细胞，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：王华茂，蔡秀梅，赵红霞，宋波，陈远梅，朱寅玉，
申请(专利权)人：科济生物医药上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31