生物催化氢化组合物及其合成罗素伐他汀手性中间体方法技术

一种选择性生物催化氢化组合物，包括葡萄糖脱氢酶、酮基还原酶和辅酶。本发明专利技术还提供了一种(3R,5S)-3,5,6-三羟基己酸叔丁酯的制备方法，将(S)-5,6-二羟基-3-氧代己酸叔丁酯与葡萄糖脱氢酶、酮基还原酶和辅酶混合进行反应制备得到(3R,5S)-3,5,6-三羟基己酸叔丁酯。本发明专利技术还提供了一种罗素伐他汀中间体的制备方法，其主要是通过选择性生物催化氢化组合物得到产品。本发明专利技术相对于目前的技术具有反应条件温和、安全环保、成本低、产物立体选择性高等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种选择性生物催化氢化组合物及其合成(3R,5S)-3,5,6-三羟基己酸叔丁酯的方法。具体来说，本专利技术属于医药中间体制备
，具体来说，本专利技术涉及生物催化合成降血脂药物罗素伐他汀手性中间体(3R,5S)-3,5,6-三羟基乙酸叔丁酯。
技术介绍
以胆固醇和甘油三酯水平过高或伴有血清高密度脂蛋白胆固醇水平过低为特征的高脂血症是引起动脉粥样硬化进而导致冠心病、高血压和脑血管疾病的主要原因。羟甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂类降脂药是目前降低胆固醇的首选药物。他汀类药物就是通过抑制HMG-CoA还原酶的通路效率来限制体内胆固醇的代谢途径，降低血浆中胆固醇和脂蛋白水平，从而起到降血脂的作用。目前已上市或正处于开发中的他汀类药物有洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、罗素伐他汀、匹伐他汀等多种。其中，罗素伐他汀是2003年上市，降低胆固醇的能力优于同类他汀类药物的新型降脂药，该药物自上市以来年销售额已远超过60亿美元，该药疗效好、安全性高、市场前景乐观。罗素伐他汀上市后，各种合成该药物及其中间体的制备方法不断公开。美国专利US5399722提供了一种制备(3R,5S)-3,5,6-三羟基己酸叔丁酯的方法：以4-氯乙酰乙酸乙酯为原料，经苄氧化后用RuCl2[(R)-BINAP]催化氢化，然后经克莱森酯缩合增长碳链，再用三乙硼不对称还原3号碳上的羰基，丙酮叉保护3,5位的羟基，再用钯碳将苄基脱去，得到丙酮叉保护的(3R,5S)-3,5,6-三羟基己酸叔丁酯。该法使用了三乙基硼试剂，需在零下60℃进行，反应条件苛刻，生产成本昂贵。另外，超低反应温度影响了不对称还原的立体选择性，造成底物转化率和产物ee值都较低。美国专利US5286883提供了一种有效的制备方法：以4-氯乙酰乙酸已酯为起始原料，经苄氧化，用Ru2X4[(R)-R3-BINAP]2N(CH2CH3)3催化氢化，并将新生成的羟基用四氢吡喃保护基进行保护，然后继续使用Ru2X4[(R)-R3-BINAP]2N(CH2CH3)3做催化剂制备第二个手性碳。在脱去保护基四氢吡喃的同时，用丙酮叉将3,5位的羟基保护起来，再将苄基脱去得到丙酮叉保护的(3R,5S)-3,5,6-三羟基己酸叔丁酯。该专利发现只有将5号碳上的羟基保护起来之后，第二次不对称催化氢化的选择性才高，并且该法的产率只有59-70％，产物ee值也只有80％-98％。中国专利200610027347.0提供了一种制备(3R,5S)-3,5,6-三羟基己酸叔丁酯的方法：从4-氯乙酰乙酸乙酯出发，经苄氧化，再用RuCl2[(R)-BINAP]催化氢化，制得(3S)-3-羟基-4-苄基丁酸乙酯。用甲氧基苄基保护羟基，克莱森酯缩合反应增长碳链，继续用RuCl2[(R)-BINAP]催化氢化3号碳上的羰基制得(3R,5S)-5-对甲氧基苄氧基-6-苄氧基-3-羟基己酸叔丁酯。用硝酸铈铵将对甲氧基苄基脱去，再用丙酮叉保护，脱去苄基，得到丙酮叉保护的(3R,5S)-3,5,6-三羟基己酸叔丁酯。该专利技术涉及了八步反应，总收率只有39.5％，产物ee值99％，成本较高，反应过程复杂，不易于大规模工业化生产。文献(3R,5S)-3,5-O-亚异丙基-3,5,6-三羟基己酸叔丁酯的合成也报道了一种有效的合成方法：以L-苹果酸为原料，经2,2-二甲氧基丙烷保护得(S)-2,2-二甲基-5-氧代-1,3-二氧杂-4-乙酸，后者与羰酰二咪唑反应得到活性酰胺(S)-2,2-二甲基-5-氧代-1,3-二氧杂-4-乙酰基咪唑。活性酰胺再与丙二酸环亚异丙酯发生缩合反应得到化合物(S)-2-(4’-氧代-3’,4’-O-亚异丙基-3’,4’-二羟基-1’-羟基-烯)-丙二酸环亚异丙酯,后者在叔丁醇的作用下醇解得到β-酮基酯，然后在甲醇钠的作用下开环得到己二酸二酯化合物。后者与硼烷和硼氢化钠立体选择性还原得到化合物(2S,4R)-1-甲基-6-叔丁基-2,4-二羟基己二酸二酯，然后再经丙酮叉保护、硼氢化钠还原得到(3R,5S)-3,5-O-亚异丙基-3,5,6-三羟基己酸叔丁酯。该报道共涉及八步反应，操作繁琐，收率较低，不利于大规模生产。上述各个文献报道的方法一般都需要6-8步化学反应，操作过程繁琐，总体收率低，不适合大规模生产。而且都是化学合成法，安全性低，污染严重，反应条件苛刻，收率低，产物立体选择性差。因此，亟需开发一种操作简便、收率较高、适合大规模生产的技术方案。
技术实现思路
本专利技术解决的技术问题是提供一种选择性生物催化氢化组合物。本专利技术解决的另一个技术问题是提供一种制备(3R,5S)-3,5,6-三羟基己酸叔丁酯的方法。本专利技术还解决的一个技术问题是提供了一种制备罗素伐他汀手性中间体的方法具体来说，本专利技术通过如下技术方案实现的：一种选择性生物催化氢化组合物，其特征在于，包括葡萄糖脱氢酶、酮基还原酶和辅酶。其中，底物：葡萄糖脱氢酶：酮基还原酶：辅酶的加入比例为1kg：(0.5kg-0.6kg)：(1kg-1.2kg)：(0.00030kg-0.00032kg)；所述辅酶为NAD+，NADP+中的一种。其中，所述酮基还原酶或葡萄糖脱氢酶的培养方法均如下：将重组的大肠杆菌接种到斜面培养基上，之后进行一级培养、二级培养、发酵罐培养、经过后处理得到酮基还原酶或葡萄糖脱氢酶；其中所述一级培养、二级培养以及发酵罐培养的温度为25℃-35℃，发酵液pH为6.5-7.5，优选一级培养、二级培养以及发酵罐培养的温度为30℃，发酵液pH为7.0。其中，所述发酵罐培养通过检测OD600确定是否结束发酵，优选所述OD600为0.6-0.8时，且不再增长时，结束发酵。其中，所述酮基还原酶或葡萄糖脱氢酶的二级培养后进行处理的过程均是：将二级培养液离心，收集菌体，并称量菌体湿重，然后按质量体积比为m菌体：v缓冲液＝1：(5～10)的浓度超声/高压破碎；破碎完全后，离心收集液体，即得酮基还原酶粗酶液或葡萄糖脱氢酶粗酶液；将得到的酮基还原酶粗酶液经絮凝、添加防腐剂、添加保护剂后得酮基还原酶或葡萄糖脱氢酶。其中，在所述二级培养的过程中，超声破碎时间为15-20分钟；所述的絮凝过程加入絮凝剂的量为2.5‰-3.5‰，所述比例是质量体积比，即1000ml粗酶液中加入2.5g-3.5g的絮凝剂；所述防腐剂为N-羟甲基甘氨酸钠，其添加量本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种选择性生物催化氢化组合物，其特征在于，包括葡萄糖脱氢酶、酮基还原酶和辅酶。

【技术特征摘要】
1.一种选择性生物催化氢化组合物，其特征在于，包括葡萄糖脱氢酶、酮
基还原酶和辅酶。
2.如权利要求1所述的选择性生物催化氢化组合物，其中底物：葡萄糖脱
氢酶：酮基还原酶：辅酶的加入比例为1kg：(0.5kg-0.6kg)：(1kg-1.2kg)：
(0.00030kg-0.00032kg)；所述辅酶为NAD+，NADP+中的一种。
3.如权利要求1或2所述的选择性生物催化氢化组合物，其中所述酮基还
原酶或葡萄糖脱氢酶的培养方法均如下：将重组的大肠杆菌接种到斜面培养基
上，之后进行一级培养、二级培养、发酵罐培养、经过后处理得到酮基还原酶
或葡萄糖脱氢酶；其中所述一级培养、二级培养以及发酵罐培养的温度为25℃
-35℃，发酵液pH为6.5-7.5，优选一级培养、二级培养以及发酵罐培养的温
度为30℃，发酵液pH为7.0。
4.如权利要求3所述的选择性生物催化氢化组合物，其中所述发酵罐培养
通过检测OD600确定是否结束发酵，优选所述OD600为0.6-0.8时，且不再增长
时，结束发酵。
5.如权利要求3或4所述的选择性生物催化氢化组合物，其中所述酮基还
原酶或葡萄糖脱氢酶的二级培养后进行处理的过程均是：将二级培养液离心，
收集菌体，并称量菌体湿重，然后按质量体积比为m菌体：v缓冲液＝1：(5～
10)的浓度超声/高压破碎；破碎完全后，离心收集液体，即得酮基还原酶粗
酶液或葡萄糖脱氢酶粗酶液；将得到的酮基还原酶粗酶液经絮凝、添加防腐剂、
添加保护剂后得酮基还原酶或葡萄糖脱氢酶。
6.如权利要求5所述的选择性生物催化氢化组合物，其中在所述二级培养
的过程中，超声破碎时间为15-20分钟；所述的絮凝过程加入絮凝剂的量为
2.5‰-3.5‰，所述比例是质量体积比，即1000ml粗酶液中加入2.5g-3.5g的絮
凝剂；所述防腐剂为N-羟甲基甘氨酸钠，其添加量为3‰-5‰，所述比例是质
量体积比，即1000ml粗酶液中加入3g-5g的防腐剂；所述保护剂为丙三醇，
其添加量为20％-40％，该比例是体积比，即100mL粗酶液加入20-40mL丙三

\t醇。
7.如权利要求3-6任一项所述的选择性生物催化氢化组合物，其中所述一
级培养、二级培养以及发酵罐培养的培养基成分为：蛋白胨10g/L-12g/L，酵
母抽提物20g/L-24g/L,甘油3g/L-5g/L，磷酸二氢钾1.8g/L-2.2g/L，磷酸氢二
钾14.5g/L-16.5g/L，硫酸镁0.5g/L-1g/L。
8.如权利要求2-7任一项所述的选择性生物催化氢化组合物，所述底物为
(S)-5,6-二羟基-3-氧代己酸叔丁酯，得到的产物为(3R,5S)-3,5,6-三羟基己酸酸
叔丁酯。
9.一种(3R,5S)-3,5,6-三羟基己酸叔丁酯的制备方法，其特征在于，将
(S)-5,6-二羟基-3-氧代己酸叔丁酯与葡萄糖脱氢酶、酮基还原酶和辅酶混合进
行反应制备得到(3R,5S)-3,5,6-三羟基己酸叔丁酯。
10.如权利要求9所述制备方法，其中所述(S)-5,6-...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴秋红，俞学锋，李知洪，姚鹃，邹林汉，余华顺，李明，付坤林，平磊，
申请(专利权)人：安琪酵母股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42