一种利用大肠杆菌全细胞催化前体酮合成依折麦布中间体的方法属于生物催化领域。大肠杆菌全细胞催化前体酮合成(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮具有非常高的立体选择性。其中(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮e.e值为99.99％，转化率约为70％。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术具体涉及一种以大肠杆菌为生物催化剂合成依折麦布中间体的方法，属于生物催化领域。
技术介绍
依折麦布是一种胆固醇吸收抑制剂，是目前为止发现的第一个ACAT(乙酰辅酶A-胆固醇酰基转移酶)抑制剂。(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮作为依折麦布的关键手性中间体，它可以由化学/生物不对称还原法或者酶催化动力学拆分其前体酮制备得到。其中，化学不对称还原法得到的目标产物光学纯度不够高，同时化学法成本较高，并且化学催化剂容易对环境造成严重的污染。与化学法相比，生物法表现出明显的立体专一性强、催化效率高和无污染等优点。目前报道的仅有两株菌株对此前体酮具有还原活性，其中，M.J.Homannhas利用微生物SchizosaccharomycesoctosporusATCC2479催化还原前体酮生产依折麦布中间体，转化率约为33％(USPatent5618707)。UttamC.Banerjee等利用Burkholderiacenocepacia全细胞进行催化还原，产率约为54％(JIndMicrobiolBiotechnol(2009)36:1369–1374)。除此之外，Codexis从高加索酸奶乳杆菌中一种R型脱氢酶出发进行定向进化，得到了可以催化合成(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮的S型脱氢酶(USPatent8415126B2)。本专利技术将大肠杆菌作为生物催化剂，与底物溶液混合后振荡反应，得到了立体纯的(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮。
技术实现思路
本专利技术的主要研究内容：本专利技术利用大肠杆菌全细胞作为生物催化剂，不对称还原后得到了依折麦布中间体(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮。一种利用大肠杆菌全细胞催化合成依折麦布手性中间体的方法，，其特征在于包括以下步骤：(1)菌株选择：选用大肠杆菌作为菌种；(2)发酵液制备：将大肠杆菌菌种接种至Luria-Bertani液体培养基中，振荡培养，获得菌株发酵液；将菌株发酵液离心后除去上清液得到湿菌体，用pH值为7.0的磷酸盐缓冲液重悬湿菌体得到湿菌体悬液；(3)不对称还原反应：将依折麦布中间体前体酮溶解在二甲基亚砜中，配成底物溶液；将步骤(2)得到的湿菌体悬液与底物溶液混合制得菌体混合液，振荡培养，得到反应液。进一步，Luria-Bertani液体培养基配方为：在950ml去离子水中加入蛋白胨10g、酵母提取物5g和氯化钠10g，超声直至溶质溶解.用5mol/LNaOH调pH至7.0，用去离子水定容至1L，在121℃下，灭菌20min。进一步，步骤(2)中所述的大肠杆菌菌种以0.1％～0.5％的体积比接种到Luria-Bertani液体培养基中，37℃，振荡培养12h。进一步，步骤(3)中所述的振荡培养的温度为37℃，时间为3～24h。进一步，所述的pH值为7.0的磷酸盐缓冲液由0.05MNa2HPO4:0.05MNaH2PO4体积比7:3混合而成。更具体的：上述的大肠杆菌(Escherichiacoli)，为常规的，可以购买。培养基为常规Luria-Bertani液体培养基，配方为：在950ml去离子水中加入蛋白胨10g、酵母提取物5g和氯化钠10g，超声直至溶质溶解.用5mol/LNaOH调pH至7.0，用去离子水定容至1L。在121℃下，灭菌20min。所用试剂是常规可购买的，蛋白胨(OXOIDTRYPTONELP0042)，酵母粉提取物(OXOIDYEASTEXTRACTLP0021)，氯化钠(分析纯国药集团化学试剂有限公司)将发酵液离心后除去上清得到湿菌体(湿菌体是指细胞内含有水分的菌体)，用pH值为7.0的磷酸盐缓冲液重悬湿菌体得到湿菌体悬液。步骤(3)中所述的不对称还原反应，将依折麦布中间体前体酮溶解在二甲基亚砜中，配成底物溶液。将底物溶液加入到湿菌体悬液中，其中每1mL反应体系中包含100mg湿菌体。混合后振荡培养。振荡培养结束，使用乙酸乙酯萃取，产物溶解在有机层中。高效液相色谱条件：化学纯分析条件(a)色谱柱：资生堂C18(b)柱温：25℃(c)流动相：A相：50mM乙酸铵水溶液(乙酸调节pH至)，B相：甲醇，A相与B相流速比为1:2(d)检测器：紫外检测器215nm光学纯分析条件(a)色谱柱：OJ-H(b)柱温：25℃(c)流动相：A相：异丙醇，B相：乙醇，A相与B相流速比为7:3(d)检测器：紫外检测器215nm本专利技术的特点：本专利技术首次采用大肠杆菌催化前体酮得到依折麦布手性中间体，提供了一种新型生物催化剂。与化学法相比，本专利技术具有立体专一性强、环境污染小和条件温和等优点。附图说明图1是依折麦布中间体前体酮的HPLC图谱图2是标准品消旋体(4S)-3-[5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮的手性HPLC图谱。图3是实施例1中大肠杆菌催化还原前体酮后的HPLC图谱。具体实施方式下面结合实施例对本方面做进一步说明，但本专利技术并不限于以下实施例实施例1本实施例为一种大肠杆菌全细胞催化合成(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮。该方法包括如下步骤：(1)菌株选择：选用大肠杆菌(EscherichiacoliBL21)作为菌种，该菌种保藏与-80℃；(2)发酵液制备：将所述的大肠杆菌菌种以0.1％的体积比接种至Luria-Bertani液体培养基中，37℃，220rpm振荡培养24h；Luria-Bertani液体培养基配方为：在950ml去离子水中加入胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g和氯化钠10g，超声直至溶质溶解.用5mol/LNaOH调pH至7.0，用去离子水定容至1L。在121℃下，灭菌20min。(3)菌体收集：取发酵液在8000rpm转速下离心10min，除去上清得到湿菌体，收集湿菌体作为生物催化剂使用；(4)不对称还原反应：用pH值为7.0的磷酸盐缓冲液重悬湿菌体得到湿菌体悬液。所述pH值为7.0的磷酸盐缓冲液由0.0本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用大肠杆菌全细胞催化合成依折麦布手性中间体的方法，，其特征在于包括以下步骤：(1)菌株选择：选用大肠杆菌作为菌种；(2)发酵液制备：将大肠杆菌菌种接种至Luria‑Bertani液体培养基中，振荡培养，获得菌株发酵液；将菌株发酵液离心后除去上清液得到湿菌体，用pH值为7.0的磷酸盐缓冲液重悬湿菌体得到湿菌体悬液；(3)不对称还原反应：将依折麦布中间体前体酮溶解在二甲基亚砜中，配成底物溶液；将步骤(2)得到的湿菌体悬液与底物溶液混合制得菌体混合液，振荡培养，得到反应液。
【技术特征摘要】
1.一种利用大肠杆菌全细胞催化合成依折麦布手性中间体的方法，，其特征在于
包括以下步骤：
(1)菌株选择：选用大肠杆菌作为菌种；
(2)发酵液制备：将大肠杆菌菌种接种至Luria-Bertani液体培养基
中，振荡培养，获得菌株发酵液；将菌株发酵液离心后除去上清液得到湿
菌体，用pH值为7.0的磷酸盐缓冲液重悬湿菌体得到湿菌体悬液；
(3)不对称还原反应：将依折麦布中间体前体酮溶解在二甲基亚砜中，
配成底物溶液；将步骤(2)得到的湿菌体悬液与底物溶液混合制得菌体
混合液，振荡培养，得到反应液。
2.按照权利要求1的方法，其特征在于，Luria-Bertani液体培养基配
方为：在950ml...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑国钧，李欣欣，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：北京;11
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。