一种食道癌易感基因位点高效分子分型的检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种食管癌易感基因位点高效分子分型的检测试剂盒。该试剂盒PCR扩增引物和PCR延伸引物是针对18个食管癌易感基因位点而设计，基于Sequenom MassArray系统，能对这18个位点高效精确分型。本发明专利技术的试剂盒通过监测分析个体的18个食管癌易感基因上的 18个位点基因携带型来评估个体对食管癌易感性。

【技术实现步骤摘要】
一种食道癌易感基因位点高效分子分型的检测试剂盒
本专利技术属于基因检测
，具体为一种食管癌易感基因位点高效分子分型的检测试剂盒。
技术介绍
食管癌是世界第八大最常见的肿瘤，分布呈现明显的区域性；中国有六大食管癌高发区,其中河南林州市和潮汕南澳岛发病率最高，严重危害当地人群的生命健康安全，如何筛查易感个体进行早期预防干预已成为当地亟待解决的社会公共卫生问题。随着高通量SNP检测芯片的飞速发展，食管癌大规模关联研究近年大量涌现，报道了一批散发食管癌易感基因和位点；本课题组致力于家族性食管癌易感基因定位研究十余年，已发现多个家族性食管癌易感基因位点；为家族性和散发性食管癌易感个体筛查奠定了坚实的基础。SequenomMassArray系统是一个高性能的DNA分析平台，具有通量、准确性、灵敏度、可重复性和成本效益的综合优势，特别适用于检测几十个DNA位点的人群筛查项目。
技术实现思路
基于18个食管癌易感基因上的18个位点可用来评估个体对食管癌易感性的基础上，本专利技术提供一种食管癌易感基因位点高效分子分型的检测试剂盒。一种食管癌易感基因位点高效分子分型的检测试剂盒，包括：PCR扩增引物；PCR延伸引物；PCR混合缓冲液（PCRBufferMix）；PCR酶（PCREnzyme）；SAP酶（SAPEnzyme）；延伸酶（ExtendEnzyme）；延伸混合缓冲液（ExtendBufferMix）；其特征在于：所述的PCR扩增引物和PCR延伸引物针对18个食管癌易感基因位点而设计，基于SequenomMassArray系统，能对这18个位点高效精确分型。具体如表1所示：表1食管癌易感基因Sequenom质谱飞行平台分子分型PCR引物和延伸引物本试剂盒中所述的一种食管癌易感基因位点高效分子分型的检测试剂盒，其特征在于：所述的引物混合物PCR产物一般在80-120bp；延伸引物3’端设计在SNP位点毗邻处，引物大小一般15-30bp，分子量4500-8000Da，Tm45°C-60°C。本试剂盒中所述的一种食管癌易感基因位点高效分子分型的检测试剂盒，其特征在于：所述的PCR扩增引物和PCR延伸引物在同一孔内与样品DNA发生反应，一次性检测18个位点判断易感性。本专利技术的有益效果是：本试剂盒基于SequenomMassArray高通量基因分型系统，对已发现的家族性食管癌易感位点和大规模关联研究报道的散发性食管癌易感位点进行有效组合，设计了特异性PCR引物和延伸引物，可以在同一孔实现18个食管癌易感基因位点的高效精确检测，具有良好的食管癌高发区易感人群筛查前景。附图说明图1为SequenomMassArray芯片扫描GPX3_rs2042235分型聚类图；图2为SequenomMassArray芯片扫描ADH1B_rs1042026，ALDH2_rs671，ATP1B2_rs1642764，PLCE1_rs2274223，SLC39A6_rs1050631，TMEM173_rs7447927位点分型聚类图；图3为食管癌易感基因位点分子分型频率及其与易感性关系；图4为食管癌大家系发现易感基因杂合性突变。具体实施方式：下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。本试剂盒是先通过用基因组DNA提取试剂盒提取外周血DNA，再用琼脂糖凝胶电泳检测DNA并对DNA定量，最后应用MassARRAY时间飞行质谱生物芯片系统（SequenomInc.）iPLEXGold模块进行SNP分型构建的，该方法具体步骤如下：①全基因组DNA提取(1)吸取20μl蛋白酶K溶液至1.5mlEP管；(2)吸取200μl全血至同一EP管；(3)吸取200μl细胞裂解液AL至同一EP管，涡旋混匀15秒；(4)56℃水浴10分钟，其间颠倒混匀1次；(5)短暂离心数秒以甩下离心管壁水雾；(6)加入200μl无水乙醇，涡旋混匀15秒，短暂离心数秒(7)将上一步所得溶液全部加入一个收集管内的吸附柱底部，6000g离心1min，扔掉收集管及其中的废液，套上一新的收集管；(7)向吸附柱中加入500μl漂洗液AW1，6000g离心1min，扔掉收集管及其中的废液，套上一新的收集管；(8)向吸附柱中加入500μl漂洗液AW2，20000g离心3min，扔掉收集管及其中的废液，套上一新的收集管；（此步骤重复一次）(9)将吸附柱套入一个干净的1.5mlEP中，向吸附膜中间位置悬空滴加80μl高压灭菌过的ddH2O，室温放置10分钟，6000g离心2min，即得到提取的DNA溶液。②DNA定量：调整浓度约为10ng/μL，A260/A280为1.7-2.0。③PCR扩增：PCR体系：PCR程序④SAP酶消化未结合的dNTP：37ºC40分钟，85ºC5分钟，4ºC；⑤配制反应体系，每孔加入2μL配好的延伸液，进行延伸反应。延伸反应：⑥加树脂离心纯化：向384样品板每孔加入16μL纯水，再通过dimpleplate将树脂加入样品板，360º旋转混匀5min，3200g离心5min；⑦点SpectroCHIP芯片上机扫描：通过MassARRAYNanodispenser将样品上清转移至芯片，设置MassARRAYmassspectrometer，输入样品及引物信息进行扫描；⑧SNP分型：应用Typer4.0软件转换原始数据为峰图文件和聚类图，确认扫描质量，将SNP成功分型为不同等位基因和基因型。结果举例：见附图1~4附图1为SequenomMassArray芯片扫描GPX3_rs2042235分型聚类图。374个食管癌高发区个体在rs2042235位点成功分型聚类，其中322个体为纯合子CC，3个体为纯合子TT，49个体为杂合子CT。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种食管癌易感基因位点高效分子分型的检测试剂盒，包括：PCR扩增引物；PCR延伸引物；PCR混合缓冲液（PCR Buffer Mix）；PCR酶（PCR Enzyme）；SAP酶（SAP Enzyme）；延伸酶（Extend Enzyme）；延伸混合缓冲液（Extend Buffer Mix）；其特征在于：所述的PCR扩增引物和PCR延伸引物针对18个食管癌易感基因位点而设计，基于Sequenom MassArray系统，能对这18个位点高效精确分型，具体如表1所示：表1食管癌易感基因Sequenom质谱飞行平台分子分型PCR引物和延伸引物 。

【技术特征摘要】
1.一种食管癌易感基因位点高效分子分型的检测试剂盒，包括：PCR扩增引物；PCR延伸引物；PCR混合缓冲液（PCRBufferMix）；PCR酶（PCREnzyme）；SAP酶（SAPEnzyme）；延伸酶（ExtendEnzyme）；延伸混合缓冲液（ExtendBufferMix）；所述的PCR扩增引物和PCR延伸引物针对13个食管癌易感基因位点而设计，基于SequenomMassArray系统，能对这13个位点高效精确分型，包括以下10个位点及其PCR扩增引物和PCR延伸引物如下所示：SNP_IDRiskAllele2nd-PCRP1st-PCRPUEP_SEQADH1B_rs1042026AACGTTGGATGGGGCATTTTATTTGAGTTCCACGTTGGATGGGGTAAGGTAAAGGATAGACAATTTCCTGTATTTAGAACTCTALDH2_rs671GACGTTGGATGTTGGTGGCTACAAGATGTCGACGTTGGATGAGGTCCCACACTCACAGTTTCTGCAGGCATACACTATP1B2_rs1642764CACGTTGGATGATCCAGACCAAGCTAAGCCGACGTTGGATGTGAACTCCTGGAATTAAGCgCTAGGGAGGTTGAGGCC12orf51_rs2074356TACGTTGGATGCACAGCTGGTAAACAGTATGACGTTGGATGAGCTGGAGTGGTTATACTGGgtGTAAACAGTATGACTTCAGATCYP1A1_rs1048943A2455GIle462ValGACGTTGGATGTGGGCAAGCGGAAGTGTATCACGTTGGATGCTGAATTCCACCCGTTGCAGtcGTGTATCGGTGAGACCCYP2E1_rs2031920Rsa1C-1053TCACGTTGGATGGTTCTTAATTCATAGGTTGCACGTTGGATGTCATTTCTCATCATATTTTCTCTTAATTCATAGGTTGCAATTTTFAT4_rs1014867Pro4972SerCACGTTGGATGAA...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏敏，黄博，
申请(专利权)人：汕头大学医学院，
类型：发明
国别省市：广东;44