一种制造技术

本发明专利技术涉及一种

【技术实现步骤摘要】
一种Hif3a基因片段敲除小鼠模型的构建方法及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种
Hif3a
基因片段敲除小鼠模型的构建方法及其应用
。

技术介绍

[0002]2020
年中国的癌症新发病例和死亡人数统计中，食管癌分居第六
、
第四位
。
食管癌是中国相对高发的癌症，以食管鳞癌为主
。
广东潮汕地区食管癌高发，以南澳岛为著，其相对独特的遗传或环境因素可能是影响这一特殊人群食管癌好发的风险因素之一
。
特别是，本专利技术在一个潮汕食管癌家族聚集案例中首次发现
HIF3A
基因存在罕见的杂合性大片段缺失
(chr19 deletion
区域
46815501
‑
46818700)。
[0003]缺氧诱导因子
(Hypoxia
‑
inducible factors,HIF)
是一种调节对低氧张力等许多适应性反应的转录因子，具有数百个缺氧诱导靶基因
。HIF
是一种
αβ
二聚体，由缺氧调节
‑
α
亚基和氧不敏感
β
亚基组成，是芳烃受体核翻译
(ARNT)
家族的成员
。HIF
的影响几乎涵盖了生理学的全部方面，包括免疫反应，胚胎发育，细胞代谢，贫血，中风，感染，心肌梗死，呼吸以及肿瘤发生等方方面面<br/>。
它的功能跟氧气息息相关，而缺氧又是决定许多疾病发展和严重程度的关键致病因素之一，包括炎症和肿瘤
。
在肿瘤进展过程中，
HIF
调节肿瘤发展的细胞和分子生物学机制主要包括：血管生成
、
癌症干细胞群的维持
、
代谢重编程；自分泌生长因子的调节；上皮
‑
间质转化
(EMT)、
侵袭
、
转移，还影响肿瘤对放疗和化疗的耐药性
。
[0004]脊椎动物中存在三种氧敏感
α
亚基不同的
HIF
亚型，即
HIF
‑
1alpha、HIF
‑
2alpha
和
HIF
‑
3alpha。HIF3A(Hypoxia
‑
inducible factor 3 subunit alpha)
不仅可以以不同的途径调节
HIF1A
和
HIF2A
，同时也是
HIF
‑1的靶基因，可调节缺氧基因的表达
。HIF3A
在染色体
19q13.2
中有
18
个外显子
。
三个独特的外显子，即外显子
1a、1b
和
1c
，可能包含变体的转录起始位点
。
外显子2编码
bHLH
域，外显子3‑9包含
PAS
域的编码序列
。
肿瘤由于局部区域的增殖
、
代谢血管构成等异常，多存在低氧区域，故与
HIF
的表达密切相关
。
目前已有研究表明
HIF3A
蛋白在肾癌
、
结直肠癌
、
胰腺癌和肝细胞癌等不同的肿瘤中表达水平有所不同
。
近几年，在大部分肿瘤相关的研究中，对
HIF3A
的研究越来越多，但并未明确
HIF3A
在肿瘤发生发展过程中的生物学功能，尤其是在食管癌的研究中还未有报道
。
[0005]目前使用
Hif3a
基因敲除
(
‑
/
‑
)
小鼠进行的一项研究表明，
Hif3a
基因敲除的小鼠未在出生后立即死亡
。
然而，敲除鼠肺重塑受损，表现为细分肺泡中次级隔壁的肺重塑受损，肺泡内皮细胞的免疫染色显示肺泡间隔缺陷空间增加在这些基因敲除小鼠的肺泡形成成熟过程中，内皮细胞增生
。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种
Hif3a
基因片段敲除小鼠模型的构建方法，本专利技术设计了特异性靶向
Hif3a
基因的两条
gRNA
，利用
Cas9
蛋白将
Hif3a
基因的
Exon 7
‑
Exon 8
敲除构建
Hif3a
基因片段敲除小鼠模型，利用本专利技术的小鼠模型可以充分研究
Hif3a
基因罕见遗
传变异在食管癌等肿瘤疾病中的影响，并为进一步理解
Hif3a
基因罕见变异在食管癌中的作用机制提供动物模型基础
。
[0007]为了进一步探寻广东潮汕地区家族性食管癌的遗传易感相关基因，本专利技术在一个潮汕食管癌家族聚集案例中首次发现了缺氧诱导因子
‑
3A
基因存在罕见的杂合性大片段缺失
(chr19 deletion
区域
46815501
‑
46818700)
，并且该大片段的缺失是主要造成
7/8
号外显子的杂合性缺失，可以影响到
HIF3
α
蛋白的
PAS
‑
B
结构域，使其对内源性配体失去敏感性
。
这些提示
Hif3a
基因的这个大片段的杂合性突变，很有可能是一个导致癌症易感的因素
。
[0008]与食管癌易感相关的变异片段，所述变异片段是
HIF3A
基因的
chr19deletion
区域
46815501
‑
46818700。
[0009]上述的基因片段在制备食管癌预防
、
治疗及检测试剂或药物的应用
。
[0010]本专利技术提供一种
Hif3a
基因片段敲除小鼠模型的构建方法，所述方法是通过设计针对
Hif3a
基因的
guide RNA
靶序列，并进行体外转录得到针对
Hif3a
基因的
guide RNA
，用
guide RNA
引导
Cas9
核酸酶将
Hif3a
基因的
Exon 7
‑
Exon8
敲除
。
[0011]优选的，所述
Hif3a
基因片段为
HIF3A
基因中的
chr19 de本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种
Hif3a
基因片段敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述方法通过设计针对
Hif3a
基因的
guide RNA
靶序列，并进行体外转录得到针对
Hif3a
基因的
guide RNA
，用
guide RNA
引导
Cas9
核酸酶将
Hif3a
基因的
Exon 7
‑
Exon8
敲除
。2.
根据权利要求1所述
Hif3a
基因片段敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述
Hif3a
基因片段为
HIF3A
基因中的
chr19 deletion
区域
46815501
‑
46818700。3.
根据权利要求1所述
Hif3a
基因片段敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)
设计针对
Hif3a
基因的
guide RNA
靶序列，并进行体外转录得到针对
Hif3a
基因的
guide RNA
；
(2)
将体外转录得到的
guide RNA
进行小鼠受精卵的注射
,
以得到
F0代小鼠，通过
PCR
及
sanger
测序的方法鉴定所获得的
F...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏敏，钱燕丽，刘志伟，刘茜，林润华，
申请(专利权)人：汕头大学医学院，
类型：发明
国别省市：