用于生产遗传改造的细胞的方法技术

公开了用于在体外生产遗传改造的细胞的方法，所述方法包括将基因组编辑组合物直接注射到细胞的细胞核内，所述基因组编辑组合物包含至少一种Cas蛋白和至少一种gRNA分子以靶向不同的基因组定位，其中用包括悬臂(4)的微机电系统注射芯片执行注射，所述悬臂(4)包括与纳米注射器(6)流体连通的微通道(5)，并且其中直接注射包括通过将纳米注射器(6)插入细胞的核内来提供微通道(5)和细胞的核之间的流体连通，和通过纳米注射器(6)经由微通道(5)将基因组编辑组合物注射到细胞的核内。组编辑组合物注射到细胞的核内。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于生产遗传改造的细胞的方法


[0001]本专利技术涉及细胞的遗传改造，特别是用于生产遗传改造的细胞的方法。

技术介绍

[0002]基因组改造工具特别地基于可编程核酸酶(PN)，其包括大范围核酸酶3、锌指核酸酶(ZNF)转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)和最突出的成簇规律间隔短回文重复(CRISPR)/CRISPR
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相关的(Cas)核酸酶类别。
[0003]用PN诱导DNA链断裂(单链断裂[SSB]和双链断裂[DSB])引发细胞DNA修复应答，以逆转损伤。在大多数情况下，DSB通过DNA的重新连接进行修复。这经常导致序列的改变和后续的非功能性基因产物。可替代地，来自分开的DNA供体分子的模板化修复可以通过同源性指导的修复(HDR)发生。这些DNA修复过程被基因组编辑利用，以引入所需的基因组改变。
[0004]基因组改造、个性化医疗和合成生物学的进步需要众多且复杂的遗传改造的细胞系。在过去的几十年里，这些细胞系已成为生物制药研究的关键，用于使得能够更好地理解基础生物学、模型疾病和开发新型的个性化治疗剂。因此，它们需要众多改造的细胞系来允许其研究并实现这些目标。
[0005]生成改造的细胞系的现有制造方法基于将DNA、RNA、蛋白质或这些大分子的组合递送至数百万个细胞的批量方法。取决于货物的性质，递送方法包括但不限于病毒载体、基于脂质的囊泡或物理方法例如电穿孔。取决于细胞类型、转染方法和/或递送的货物，转染率从0到99％不等。另外，所有这些方法都可能对细胞具有毒性作用，导致坏死或程序性细胞死亡。如果转染率足够高(>90％)，则多克隆批量培养物可以用于特定应用。
[0006]然而，在基础生物学中以及对于翻译应用，需要单克隆细胞系。在这些大分子的成功递送后，需要繁琐的选择过程来鉴定且分离改变的细胞，以生成单克隆细胞系。这可以通过添加可选择标记物来实现，所述可选择标记物例如编码荧光蛋白或药物抗性的质粒，以通过FACS或药物选择来纯化细胞。所选择的细胞形成克隆集落，并且收集各个集落的子样品以测试是否存在所需的修饰。正确修饰的细胞克隆经受几轮连续稀释，以确保真正的单克隆性。总体而言，这个过程是繁琐的、耗时的并且无法良好地按比例缩放。当在同一细胞中执行多重修饰时，按比例缩放问题甚至进一步恶化，因为生成时间随着每一种另外的修饰/编辑大致线性地按比例缩放。关于具有n种修饰的细胞系的生成时间是n乘以10周。此外，由于低转染效率，许多已知过程无法提供靶细胞中的所需改造组分，例如CRISPR组分的实际浓度的充分控制。

技术实现思路

[0007]本专利技术的一般目的是提高用于生产遗传改造的细胞的方法的技术水平，并且优选完全或部分地克服现有技术的缺点。在有利的实施方案中，提供了用于生产遗传改造的细胞的方法，其可以在比现有技术中已知的方法明显更少的时间内完成。在进一步有利的实施方案中，提供了用于生产遗传改造的细胞的方法，其允许更方便和/或更快速的生成单克
隆细胞集群的方法。
[0008]在第一个方面，一般目的通过根据权利要求1的用于在体外生产遗传改造的细胞的方法来实现。该方法包括将基因组编辑组合物直接注射到细胞的核内，所述细胞优选贴壁细胞，即粘附到表面的细胞。基因组编辑组合物包含至少一种Cas蛋白和针对待编辑的基因组定位的至少一种gRNA分子。gRNA通常由两个功能部分组成：负责结合Cas蛋白的发夹结构以及与待靶向的DNA互补的序列。用包括悬臂的微机电系统注射芯片执行注射，所述悬臂可以特别是AFM悬臂，其中所述悬臂包括与悬臂的纳米注射器流体连通的微通道。直接注射包括通过将纳米注射器插入细胞的核内来提供微通道和细胞的核之间的流体连通，和通过纳米注射器经由微通道将基因组编辑组合物注射到细胞的核内。根据本专利技术的方法使得能够将基因组编辑组合物直接引入单细胞的核内，这尤其允许免除改造的Cas蛋白，例如包含NLS序列(核定位序列)的Cas蛋白。与批量转染至数千个细胞形成对比，由于可以准确地控制化学计量，提供了更加可靠和可控的方法。另外，可以精确地确定注射到每个核内的基因组编辑组合物的体积。单细胞本身然后可以用作用于扩增的原始来源，以便提供单克隆细胞系，其随后固有地是单克隆的。因此，避免了繁琐的细胞选择和分析过程。由于细胞通过悬臂式纳米注射器的力反馈渗透，注射像这样是可准确地控制的，从而避免了细胞损伤和因此的细胞死亡，这最终增加了成功改造的细胞的量。一般而言，悬臂弯曲可以由激光束控制，如例如与配置用于接收从悬臂反射的激光束的光电二极管组合在AFM中常见的。
[0009]此外，根据本专利技术的微机电系统注射芯片的使用允许在短时间内，即在1秒至60秒内执行注射步骤本身而不失去控制。
[0010]应理解，gRNA可以包含具有结合Cas蛋白的支架以及与靶向DNA区域互补的间隔物的单个RNA。可替代地，gRNA可以包含与靶DNA互补的crRNA以及负责Cas结合的tracrRNA。应理解，crRNA和tracrRNA必须在与Cas蛋白结合之前进行退火。
[0011]Cas蛋白应理解为CRISPR相关蛋白。在与gRNA结合后，Cas蛋白可以被导向限定的基因组定位。Cas蛋白可以包括诱导SS(切口酶)和DS断裂的核酸酶以及无催化活性的核酸酶。Cas蛋白可以被改造为含有碱基编辑器活性、转录激活或阻遏结构域和其它感兴趣的活性。应理解，该权利要求并不限于来自特定种类的特定Cas蛋白(例如Cas9)，而是扩展到其它类型的Cas蛋白(1类，I、III、IV型，2类，II、V、VI型)
[0012]应进一步理解，对于待靶向的每个DNA序列，存在与结合Cas蛋白的DNA互补的个别gRNA对。因此，为了一次靶向几个基因组基因座，必须存在至少一种gRNA/Cas复合物，其包括与靶位点互补的gRNA。
[0013]纳米注射器应理解为一种结构特征，其包括具有开口的尖端，其允许在1
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60秒内注射在小于1nL，优选小于1pL的范围内的体积，以及对水溶液例如基因组编辑组合物1
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5000毫巴的施加压力。在亚微米范围(纳米范围)内的开口，例如直径为10
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1500nm，优选为10至999nm的开口，适合于满足这些条件。
[0014]在一些实施方案中，纳米注射器的开口具有小于10μm，优选小于5μm的尺寸，特别是直径。特别地，开口可以具有10nm至5μm，例如0.1μm至1.5μm的尺寸，特别是直径。
[0015]在一些实施方案中，纳米注射器可以具有金字塔结构，其中开口布置在金字塔结构的壳表面上。此类纳米注射器是有利的，因为金字塔结构的顶点充当尖锐的穿刺尖端，从而提供明确的细胞穿刺。
[0016]在一些实施方案中，纳米注射器可以包括配置为纳米注射器尖端的中空管状主体，优选地至少部分地具有圆柱形形状。
[0017]在一些实施方案中，悬臂和/或微通道，特别是微通道的壁涂布有防污剂，例如有机聚硅氧烷，特别是卤代有机聚硅氧烷。合适本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.用于生产遗传改造的细胞的体外方法，所述方法包括将基因组编辑组合物直接注射到细胞的核内，所述基因组编辑组合物包含至少一种Cas蛋白和针对待编辑的基因组定位的至少一种gRNA分子，其中用包括悬臂(4)的微机电系统注射芯片执行注射，所述悬臂(4)包括与纳米注射器(6)流体连通的微通道(5)，并且其中直接注射包括通过将纳米注射器(6)插入细胞的核内来提供微通道(5)和细胞的核之间的流体连通，和通过纳米注射器(6)经由微通道(5)将基因组编辑组合物注射到细胞的核内。2.根据权利要求1的方法，其进一步包括扩增所产生的细胞，以生成第一单克隆细胞培养物。3.根据权利要求2的方法，其中将第一单克隆细胞培养物的细胞分成第一亚组和第二亚组，其中通过测序分析所述第一亚组的细胞，并且其中所述第二亚组的细胞进行进一步扩增，以生成第二单克隆细胞培养物。4.根据权利要求3的方法，其中将第一单克隆细胞培养物的细胞另外分成第三亚组，其中所述第三亚组的细胞进行进一步扩增，以产生第三单克隆细胞培养物。5.根据前述权利要求中任一项的方法，其中在直接注射之前，提供了包含多个细胞，特别是1至1000个细胞的细胞制剂，并且执行基因组合物直接注射到细胞制剂的一个或多个细胞内，并且其中在基因组编辑组合物的直接注射后，选择注射了基因组编辑组合物的单细胞，并且将其从细胞制剂中分离，并且任选地随后个别地扩增，以生成第一单克隆细胞培养物。6.根据权利要求5的方法，其中所述单细胞的选择和分离包括借助于微机电系统转运芯片来移动单细胞，所述微机电系统转运芯片包括悬臂(4')，其具有开口(7')和延伸穿过悬臂(4')到开口(5')的微通道(5')，其中移动通过对微通道(5')施加负压使得单细胞粘附到悬臂(4')来执行。7.根据权利要求1至4中任一项的方法，其中在基因组编辑组合物直接注射到细胞的核内之前，特别是在分开的孔中分离单细胞。8.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述基因组编辑组合物进一步包含转染标记物，特别是荧光转染标记物和/或编码转染标记物，特别是荧光转染标记物的质粒或mRNA。9.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：T，
申请(专利权)人：细度速治股份公司，
类型：发明
国别省市：