一种研究Abd-A基因调控拟穴青蟹幼体腹肢发育的RNA干扰方法技术

本发明专利技术公开了一种研究Abd

【技术实现步骤摘要】
一种研究Abd
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A基因调控拟穴青蟹幼体腹肢发育的RNA干扰方法


[0001]本专利技术涉及水产生物
，具体为一种研究Abd
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A基因调控拟穴青蟹幼体腹肢发育的RNA干扰方法。

技术介绍

[0002]拟穴青蟹(Scyllaparamamosain)隶属于甲壳动物纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、梭子蟹科(Portunidae)，主要分布于西太平洋、东南亚、澳大利亚、印度洋、南非等海域。
[0003]拟穴青蟹早期幼体发育经历了从胚胎孵化破膜成溞状幼体、到大眼幼体、再到仔蟹的生长阶段，期间伴随一系列肢体发育和特化过程。其中，腹肢的生长和形态的变化扮演着重要角色，直接关系到幼体能否顺利完成变态发育进入到下一生长阶段。因此，幼体发育阶段成为拟穴青蟹人工培育过程中至关重要的一环。对幼体发育基础理论问题的解析以及内在驱动因子的机制研究显得尤为必要。目前在拟穴青蟹幼体中开展的基因功能研究，主要限于基因克隆和表达模式分析。
[0004]拟穴青蟹溞状幼体需经历4次蜕皮，共分为5个时期，且溞状幼体每个时期的发育时间约为2
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3天，在RNA干扰的时效期内，可顺利观察到上个时期溞状幼体到下个时期的腹部发育的变化，从而揭示基因在幼体形态变化中的功能。但拟穴青蟹幼体体型小(2
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3mm)，肉眼不易观察，不能采用常规的注射方法进行RNA干扰，只能采取显微注射的方式将外源物质导入幼体体内。但是溞状幼体具有角质外壳，毛细管针不易刺透，使得利用RNA干扰技术研究拟穴青蟹幼体中的基因功能受到阻碍。因此，有必要开发出一种简单高效的针对拟穴青蟹幼体的RNA干扰技术。
[0005]相关文献报道：Abd
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A基因是Hox基因家族重要成员，广泛存在于多个物种中，目前在昆虫中的研究较多，其主要参与昆虫腹节的产生、体节前后轴的分化、生殖腺和脂肪体的发育、心脏的分化、中肠和腹肢的形成等发育过程。在甲壳动物中，有学者通过Abd
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A在克氏原螯虾各体节的表达情况推测Abd
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A基因负责确立腹部属性并控制胸部前后附肢的形态和功能分化；在凡纳滨对虾中，Abd
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A基因在溞状幼体时期开始活跃表达，结合组织器官发生情况，推测Abd
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A控制凡纳滨对虾胸腹部体节和腹肢的发育和形态特征。拟穴青蟹中Abd
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A基因发挥什么样的功能，是否在腹肢发育中发挥了关键作用，目前没有相关报道。

技术实现思路

[0006](一)解决的技术问题
[0007]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种研究Abd
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A基因调控拟穴青蟹幼体腹肢发育的RNA干扰方法，探究Abd
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A基因在腹肢发育中的功能。本专利技术探索出一种从拟穴青蟹幼体头胸甲与腹部连接处的背壳间隙将dsRNA注射入幼体体内的方法，克服了幼体个体小且外壳不易刺透的技术问题。
[0008](二)技术方案
[0009]为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：一种研究Abd
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A基因调控拟穴青蟹幼体腹肢发育的RNA干扰方法，以拟穴青蟹幼体为研究对象，并以Abd
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A为目的基因，具体包括以下步骤：
[0010]S1、根据Abd
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A基因序列设计用于扩增Abd
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A基因片段和合成dsRNA的特异性引物，在用于合成dsRNA的正反引物5
’
端添加保护碱基和T7启动子序列；
[0011]S2、以带有Abd
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A基因序列片段的质粒为模板进行PCR扩增和产物纯化，以此PCR产物(带T7启动子)为模板，经体外转录合成基因干扰用dsRNA；
[0012]S3、将拟穴青蟹IV期溞状幼体置于特制琼脂糖凝胶板上，再将dsRNA与注射指示剂混合，然后利用显微注射仪将混合物注射入幼体体内，注射dsRNA浓度为100ng/μl，注射剂量为1μg/g；
[0013]S4、待幼体成长至V期，采用电镜观察幼体腹肢发育变化。
[0014]以带有Abd
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A基因序列片段的质粒为模板进行后续的PCR反应，克服了拟穴青蟹基因组序列高重复率可能带来的错配问题，所获得的PCR产物准确率更高，符合预期条带率达到100％。
[0015]所述Abd
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A基因cDNA全长为1,282bp，用于合成dsRNA的长度为266bp。
[0016]优选的，所述步骤S2中带有目的基因序列片段的质粒的构建包括以下步骤：
[0017]T1、以拟穴青蟹溞状幼体的cDNA为模板，设计引物克隆Abd
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A基因片段，采用高保真酶，配制反应体系，设计引物克隆目的基因的开放阅读框(Open ReadingFrame，ORF)，采用高保真酶预混液，反应体系如下：
[0018][0019]T2、将反应体系加到PCR管中，混匀离心，放入PCR仪中进行扩增反应，将以上体系加到200μL的PCR管中，混匀离心，放入PCR仪中，程序如下：
[0020][0021]T3、反应结束后，使用1.5％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，将符合预期的条带进行切胶回收，纯化之后转入pEASY
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T1
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simple载体；
[0022]T4、选取带有正确目的片段的质粒进行提取纯化，获得带有正确Abd
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A基因序列片段的质粒。
[0023]优选的，所述PCR反应体系为50μL，包括dsAbd
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A
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F(10μM)2.5μL，dsAbd
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A
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R(10μM)2.5μL，2
×
HieffCanaceGoldPCRMasterMix1.2μL，cDNA模板(10ng/μL)2μL，然后ddH2O补足至50μL；
[0024]所述PCR扩增所用的PCR反应程序为：98℃预变性3min，98℃变性10s，68℃延伸40s，35个循环，最后72℃延伸5min，4℃保存。
[0025]优选的，所述基因干扰用的dsRNA合成包括以下步骤：
[0026]E1、采用带有Abd
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A基因序列的质粒为模板，使用高保真酶进行PCR反应，，体系如下：
[0027][0028]反应程序与上述相同。
[0029]E2、反应结束后，使用1.5％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，将符合预期的条带进行切胶回收并纯化PCR产物；
[0030]E3、dsRNA的体外转录：采用T7体外转录试剂盒，体系如下：
[0031][0032]在PCR管中轻轻混匀，转入PCR仪中42℃中控温5h，加入DNase，混合均匀置于PCR仪中37℃，30min，去除未反应完的DNA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种研究Abd
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A基因调控拟穴青蟹幼体腹肢发育的RNA干扰方法，其特征在于：以拟穴青蟹幼体为研究对象，并以Abd
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A为目的基因，具体包括以下步骤：S1、根据Abd
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A基因序列设计用于扩增Abd
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A基因片段和合成dsRNA的特异性引物，在用于合成dsRNA的正反引物5
’
端添加保护碱基和T7启动子序列；S2、以带有Abd
‑
A基因序列片段的质粒为模板进行PCR扩增和产物纯化，以此PCR产物(带T7启动子)为模板，经体外转录合成基因干扰用dsRNA；S3、将拟穴青蟹IV期溞状幼体置于特制琼脂糖凝胶板上，再将dsRNA与注射指示剂混合，然后利用显微注射仪将混合物注射入幼体体内，注射dsRNA浓度为100ng/μl，注射剂量为1μg/g；S4、待幼体成长至V期，采用电镜观察幼体腹肢发育变化。2.根据权利要求1所述的一种研究Abd
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A基因调控拟穴青蟹幼体腹肢发育的RNA干扰方法，其特征在于：所述步骤S2中带有目的基因序列片段的质粒的构建包括以下步骤：T1、以拟穴青蟹溞状幼体的cDNA为模板，设计引物克隆Abd
‑
A基因片段，采用高保真酶，配制反应体系；T2、将反应体系加到PCR管中，混匀离心，放入PCR仪中进行扩增反应；T3、反应结束后，使用1.5％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，将符合预期的条带进行切胶回收，纯化之后转入pEASY
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T1
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simple载体；T4、选取带有正确目的片段的质粒进行提取纯化，获得带有正确Abd
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A基因序列片段的质粒。3.根据权利要求1或2所述的一种研究Abd
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A基因调控拟穴青蟹幼体腹肢发育的RNA干扰方法，其特征在于：所述PCR反应体系为50μL，包括dsAbd
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A
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F2.5μL，dsAbd
‑
A
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R2.5μL，2
×
HieffCanaceGoldPCRMaster Mix1.2μL，cDNA模板2μL，然后ddH2O补足至50μL；所述PCR扩增所用的PCR反应程序为：98℃预变性3min，98℃变性10s，68℃延伸40s，35个循环，最后72℃延伸5min，4℃保存。4.根据权利要求1或2所述的一种研究Abd
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A基因调控拟穴青蟹幼体腹肢发育的RNA干扰方法，其特征在于：所述基因干扰用的dsRNA合成包括以下步骤：E1、采用带有Abd
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A基因序列的质粒为模板，使用高保真酶进行PCR反应；E2、反应结束后，使用1.5％琼脂糖凝胶...

【专利技术属性】
技术研发人员：张银，马洪雨，项梓菲，余小燕，陈亚丽，高伟峰，
申请(专利权)人：汕头大学，
类型：发明
国别省市：