一种重度免疫缺陷羊模型的构建方法及其应用技术

本发明专利技术提供一种重度免疫缺陷羊模型的构建方法及其应用，属于生物医药技术领域。本发明专利技术所述方法利用Crisp/Cas9技术结合显微注射技术，利用靶向于RAG2基因的第1外显子和IL2RG基因的第3外显子设计的sgRNA联合敲除RAG2和IL2RG基因，获得免疫缺陷羊模型。该方法可直接一步法实现多个基因同时高效敲除，制备出完全缺失T细胞、B细胞和NK细胞的重度免疫缺陷羊，避免了连续核移植表观修饰异常和克隆动物存活异常等问题，构建方法简单高效，更利于后续的应用研究，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。价值。价值。

【技术实现步骤摘要】
一种重度免疫缺陷羊模型的构建方法及其应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种重度免疫缺陷羊模型的构建方法及其应用。

技术介绍

[0002]免疫缺陷动物是人源化动物构建的基础，同时也是很多特殊病毒及干细胞及肿瘤移植等细胞治疗和药物筛选的安全性和有效性评价的重要模型。免疫小鼠在生物医药研究领域具有广泛的应用，但小鼠由于自身体型、解剖结构、生理代谢水平以及免疫系统和人存在巨大差异，用其进行的实验结果往往存在巨大误差，因此临床前的药物实验需在啮齿类、大动物以及非人灵长类进行三轮动物实验。目前大动物评价模型种类单一，且免疫缺陷大动物存在长期存活困难，对于特定人类疾病和生理代谢及免疫状态的模拟迫切需要开发多种类合适且存活时间长的大动物模型。
[0003]免疫系统组成复杂，主要分为髓系和淋巴系两部分，目前常见的免疫缺陷动物模型主要针对淋巴系细胞功能进行缺陷，针对动物模型的制备主要是通过细胞水平进行编辑，筛选单克隆细胞鉴定后再进行克隆制备动物模型，然而单克隆细胞筛选效率低且耗时漫长，会出现连续核移植表观修饰异常和克隆动物存活异常的情况，且克隆程序繁琐并存在发育异常及克隆效率低下等一系列问题。目前为止，未见利用显微注射高效敲除相关基因获得免疫缺陷羊的报道。

技术实现思路

[0004]本专利技术目的在于提供一种利用Crisp/Cas9技术结合显微注射技术，获得RAG2和IL2RG基因敲除的重度免疫缺陷羊动物模型的构建方法和应用，该方法简单易行，能够高效快速获得重度免疫缺陷羊模型，该模型完全缺失T细胞、B细胞和NK细胞。
[0005]为实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：
[0006]一种重度免疫缺陷羊模型的构建方法，包括如下步骤：利用靶向于RAG2基因的第1外显子和IL2RG基因的第3外显子设计的sgRNA联合敲除RAG2和IL2RG基因，获得重度免疫缺陷羊模型。
[0007]优选的，利用靶向于RAG2基因的第1外显子设计的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
[0008]优选的，利用靶向于IL2RG基因的第3外显子设计的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
[0009]优选的，将所述的sgRNA与Cas9 mRNA或能够形成该sgRNA与Cas9mRNA的构建物引入到羊的受精卵内；使受精卵发育，获得重度免疫缺陷羊模型。
[0010]本专利技术提供一种重度免疫缺陷羊模型的构建方法，包括如下步骤：(1)根据羊的RAG2和IL2RG基因序列，设计并筛选sgRNA位点；(2)将步骤(1)的sgRNA连接至载体上，得到重组质粒；(3)将Cas9 mRNA质粒和步骤(2)的重组质粒转染细胞，筛选出高效sgRNA；(4)将
筛选的高效sgRNA和Cas9 mRNA进行体外转录，组合并分装，引入羊的受精卵中，得到重度免疫缺陷羊模型。
[0011]优选的，所述受精卵为1
‑
细胞期的受精卵。
[0012]本专利技术提供用于制备重度免疫缺陷羊模型的试剂盒，包括所述的sgRNA。
[0013]优选的，还包括Cas9 mRNA。
[0014]本专利技术提供所述的构建方法以及使用所述的试剂盒构建得到的重度免疫缺陷羊模型的应用，用于制备进行肿瘤研究及药物筛选、干细胞研究或免疫系统人源化研究的动物模型。
[0015]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
[0016](1)本专利技术首次原创性地利用Crisp/Cas9技术结合显微注射技术，采用体外转录两对sgRNA敲除RAG2和IL2RG基因，获得多基因同时敲除的重度免疫缺陷羊模型。该方法可直接一步法实现多个基因同时高效敲除，无需通过复杂的体细胞基因编辑筛选和低效的体细胞核移植环节，避免了连续核移植表观修饰异常和克隆动物存活异常等问题。
[0017](2)本专利技术所述构建方法高效快速且简便易行，制备的模型免疫缺陷程度更高，完全缺失T细胞、B细胞和NK细胞，更利于后续的应用研究，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
附图说明
[0018]图1筛选的、分别靶向RAG2和IL2RG基因的sgRNA位置图解(下划线的序列为靶标序列，红色的碱基为PAM序列)。
[0019]图2获得的RAG2和IL2RG均为纯合敲除的免疫缺陷羊(WT为野生型羔羊；27
‑
1，27
‑
2，110
‑
1均为RAG2和IL2RG基因缺陷羔羊)。
[0020]图3三只免疫缺陷羊的基因型鉴定结果。
[0021]图4野生型羊和免疫缺陷羊中胸腺和脾脏的病理鉴定(标尺为300μm)。
[0022]图5免疫缺陷羊的外周淋巴细胞的流式检测(WT
‑
PBL为野生型羔羊的外周淋巴细胞，110
‑1‑
PBL为RAG2和IL2RG免疫缺陷羔羊的外周淋巴细胞，FSC为散向粒子分布)。
[0023]图6免疫缺陷羊免疫细胞的10X单细胞测序图一(a采用10X单细胞测序的流程图；b羊外周血中，免疫细胞组成的UMAP可视化分析；c为不同免疫细胞的特征性基因的点图分析)。
[0024]图7免疫缺陷羊免疫细胞的10X单细胞测序图二(d每个细胞群中表达量前十的差异性基因(p值<＝0.05，差异倍数>＝1.5)的分析；e羊免疫细胞特征性表达基因的UMAP可视化分析；f为C1
‑
C4淋巴细胞特征性表达标记基因的UMAP可视化分析；g为C7
‑
C9粒细胞特异性表达的标记基因的UMAP可视化分析；h为测序获得的各细胞类群比例)。
[0025]图8单细胞测序图谱揭示的免疫缺陷羊的免疫细胞数量表征(a为野生型和免疫缺陷羊中免疫细胞组成的UMAP可视化分析；b野生型和免疫缺陷羊中免疫细胞群差异的UMAP可视化分析；c为不同细胞特征性基因的表达；d为野生型和免疫缺陷羊的免疫细胞组成；e为野生型和免疫缺陷羊中免疫细胞组成的差异)。
[0026]图9人黑色素肿瘤细胞mel888移植免疫缺陷羊的结果(a为mel888细胞腹部皮下注射于免疫缺陷羊的示意图；b为皮下注射细胞的数量和体积，其中22
‑
1和27
‑
1为免疫缺陷
羊，45
‑
1为野生型羊；c为注射后25天内肿瘤细胞的生长曲线；d为HE染色结果；e为免疫组合染色结果。黑色标尺300μm，白色标尺为100μm)
[0027]图10鹿茸骨膜移植免疫缺陷羊的结果(a为鹿茸骨膜于免疫缺陷羊头部的示意图；b为鹿茸骨膜移植15
‑
35天内，骨膜细胞的生长曲线；c为移植鹿茸骨膜的免疫缺陷羊的基因型，其中45
‑
2和45
‑
4为野生型羊，22
‑
1、27
‑
1和30
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重度免疫缺陷羊模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：利用靶向于RAG2基因的第1外显子和IL2RG基因的第3外显子设计的sgRNA联合敲除RAG2和IL2RG基因，获得重度免疫缺陷羊模型。2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，利用靶向于RAG2基因的第1外显子设计的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，利用靶向于IL2RG基因的第3外显子设计的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。4.如权利要求1～3任意一项所述的构建方法，其特征在于，将所述的sgRNA与Cas9mRNA或能够形成该sgRNA与Cas9mRNA的构建物引入到羊的受精卵内；使受精卵发育，获得重度免疫缺陷羊模型。5.如权利要求1～4任意一项所述的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)...

【专利技术属性】
技术研发人员：王清未，邹惠影，顾士钢，
申请(专利权)人：顾士钢，
类型：发明
国别省市：