一种适合对小型昆虫进行基因编辑的方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及适合对小昆虫进行基因编辑的方法。包括显微注射步聚、饲养步骤和基因组DNA质量及敲除后代检测方法。本发明专利技术通过研究对操作过程中涉及到的关键参数和具体方式进行探索得以对小型昆虫进行有效的基因编辑。由此本发明专利技术突破小型昆虫基因编辑注射难和检测难的技术瓶颈，为该领域研究人员提供一种更方便、高效、可行的实验方法。可行的实验方法。

【技术实现步骤摘要】
一种适合对小型昆虫进行基因编辑的方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及适合对小昆虫进行基因编辑的方法。

技术介绍

[0002]近年来，基因编辑技术的不断发展使得昆虫基因组编辑成为可能。CRISPR
‑
Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeat
‑
CRISPR
‑
associated nuclease 9)基因编辑技术是一种由RNA引导的基因组靶向编辑技术。研究学者们对CRISPR
‑
Cas9基因编辑技术不断优化，使得该技术在生物学研究的众多领域中得以推广和应用。迄今为止，研究学者们利用CRISPR
‑
Cas9系统已经在黑腹果蝇Drosophila melanogaster、家蚕Bombyx mori Linnaeus、埃及伊蚊Aedes aegypti等多种昆虫中开展了研究并取得一定成果。
[0003]蓟马相较于上述昆虫而言，是一种体型较小的昆虫(体长为0.9
‑
1.2mm)，且卵不具卵壳，隐藏在叶片内部，一般的卵期注射技术无法适用于蓟马。因此，急需研究适用于小型昆虫的基因编辑方法。

技术实现思路

[0004]基于上述需求，本专利技术通过研究对操作过程中涉及到的关键参数和具体方式进行探索得以对小型昆虫进行有效的基因编辑。
[0005]本专利技术提供一种适合对小昆虫(例如蓟马，更具体如西花蓟马)进行基因编辑的方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0006]S1显微注射步聚，具体如下：
[0007]使用微量上样针吸取制备好的sgRNA和Cas9蛋白混合液(优选使用时冰上放置)，加入到磨好的毛细针头中，将加好注射液的毛细针头固定到显微注射仪上(优选地在进行注射处理前需将载玻片进行低温处理)；其中所述毛细针头按如下方法制备得到：向上打开拉针仪保护盖(优选地设置拉针仪的参数：HEAT＝600，PULL＝40，VEL＝45，DEL＝225)，将显微注射用毛细玻璃管固定在拉针仪上，合上拉针仪保护盖，运行后取下拉好的针头，用磨针仪打磨针头尖端；
[0008]用昆虫针挑取雌虫置于载玻片，使其腹面朝上，用昆虫针按住腹部，使腹部微微隆起；操作显微注射仪将注射毛细针头移至虫体上方，使针头向下扎入雌虫腹部，进行注射；其中，将雌虫先于冰上使其休眠后(具体放置2
‑
3分钟)再进行显微注射操作；
[0009]S2：饲养步骤，具体如下：待注射好的雌虫恢复活力后进行饲养(优选地将其转移到塑料瓶(5cm
×
10cm)进行饲养，放置四季豆荚，每隔两天更换新鲜的豆荚；饲养条件：温度26
±
1℃，湿度40
‑
60％)。
[0010]进一步地，还包括下述步骤：
[0011]S3：基因编辑后代检测步骤，取S2饲养后的子代成虫的翅和/或后足进行检测，具体如下：
[0012]S3
‑
1取成虫虫的翅和/或后足：
[0013]取S2饲养后的成虫先于冰上使其休眠后(具体放置2
‑
3分钟)再进行翅、后足和躯体的组织分离；
[0014]在组织分离时将载玻片进行低温处理，用昆虫针挑取单头成虫，使其腹面朝上，用昆虫针将两对翅展开，一根针按住翅的基部，另一根针拨动躯体，轻轻将翅依次扯下；
[0015]取后足时需将虫体腹面朝下，一根针按住后足基节处，另一根针按住腿节处，轻轻拉扯使其在转节处分离，依次将一对后足取下；
[0016]将剩下的虫体待其复苏后继续进行饲养，饲养条件：温度26
±
1℃，湿度40
‑
60％；
[0017]S3
‑
2组织研磨：
[0018]将研磨杵插入上述PCR管中反复研磨2
‑
3min，研磨完毕后，提取组织DNA。
[0019]优选地，所述组织DNA提取方法如下：
[0020]在AD1 buffer中加入AD2 buffer，枪头吹吸混匀(优选地，将AD1和AD2按比例4:1预混，每个反应加入12.5μL预混液,放置在冰上，2小时内使用)；
[0021]用昆虫针在体视显微镜下扯下西花蓟马雌虫的翅和/或后足，转移到加有预混裂解液的PCR管中；55℃孵育10min，之后95℃孵育3min；
[0022]加入与AD1等体积的AD3 buffer，混匀后直接作为模板进行PCR或
‑
20℃保存。
[0023]更进一步地，还包括如下步骤：
[0024]S4：基因组DNA质量及敲除后代检测，具体如下：采用天根生物的2
×
Taq PCR MasterMixⅡ(with dye)，按照说明书配制PCR体系和运行PCR程序，用1.5％
‑
2％琼脂糖凝胶电泳检测目的条带大小及亮度。
[0025]由此本专利技术突破小型昆虫基因编辑注射难和检测难的技术瓶颈，为该领域研究人员提供一种更方便、高效、可行的实验方法。例如，通过本专利技术可用于将工程Cas9蛋白和sgRNA的复合物直接注射到雌成虫腹部卵巢位置，以达到对目的基因进行敲除的目的，从而更系统地阐明目的基因对蓟马生长发育的影响。因此，本专利技术具有实际应用价值。
附图说明
[0026]图1、显微注射示意图。
[0027]图2、组织分离示意图。
[0028]图3、试剂盒筛选结果。
[0029]图4、PCR Mix筛选结果(A：天根；B：全式金)。其中，前8个条带：Animal Tissue PCR Kit；后8个条带：Micro Genomic DNA Kit。
[0030]图5、FoUBLC11基因敲除结果。
具体实施方式
[0031]下面通过具体实施例对本专利技术进行阐述，以更好的理解本专利技术，但并不构成对本专利技术的限制。
[0032]1.实验材料
[0033]西花蓟马雌成虫
[0034]2.主要实验仪器及试剂
[0035]2.1实验仪器
[0036]拉针仪(SU
‑
P97 Flaming/Brown Pipette Puller)，磨针仪(EG
‑
400型微电极研磨仪)，Microloader
TM
‑
微量上样针(Eppendorf)，昆虫针(00#)，显微注射仪和操作仪(Eppendorf)。
[0037]2.2实验试剂
[0038]精密gRNA合成试剂盒(英潍捷基上海贸易有限公司)；
[0039]PCR&DNA Cleanup Kit(赛默飞世尔科技公司)；
[0040]2×
Taq PCR MasterMixⅡ(with dye)(天根生化科技(北京)有限公司本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种适合对小昆虫进行基因编辑的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1显微注射步聚，具体如下：使用微量上样针吸取制备好的sgRNA和Cas9蛋白混合液，加入到磨好的毛细针头中，将加好注射液的毛细针头固定到显微注射仪上；其中所述毛细针头按如下方法制备得到：向上打开拉针仪保护盖，将显微注射用毛细玻璃管固定在拉针仪上合上拉针仪保护盖，运行后取下拉好的针头，用磨针仪打磨针头尖端；用昆虫针挑取雌虫置于载玻片，使其腹面朝上，用昆虫针按住腹部，使腹部微微隆起；操作显微注射仪将注射毛细针头移至虫体上方，使针头向下扎入雌虫腹部，进行注射；S2：饲养步骤，具体如下：待注射好的雌虫恢复活力后进行饲养。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，设置拉针仪的参数为：HEAT=600，PULL=40，VEL=45，DEL=225。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，S1步，所述sgRNA和Cas9蛋白混合液使用时冰上放置；在进行注射处理前将载玻片进行低温处理，具体放于冰上放置5
‑
10分钟；所述雌虫先于冰上使其休眠后（具体放置2
‑
3分钟）再进行显微注射操作。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，S2步中，饲养条件是将注射后的雌虫转移到塑料瓶进行饲养，放置四季豆荚，每隔两天更换新鲜的豆荚；饲养条件：温度26
±
1℃，湿度40
‑
60%）。5.如权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于，还包括下述步骤：S3：基因编辑后代检测步骤，取S2饲养后的子代成虫的翅和/或后足进行检测，具体如下：S3
‑
1 取子代成虫的翅和/或后足：取S2饲养后的子代成虫先于冰上使其休眠后（具体放置2
‑
3分钟）再进行翅、后足和躯体的组织分离；在组织分离时将载玻片进行低温处理，用昆虫针挑取单头成虫，使其腹面朝上，用昆虫针将两对...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴青君，袁江江，曹鸿一，唐映曦，钱康华，郑晓斌，王京，张莹，丰久明，
申请(专利权)人：三亚中国农业科学院国家南繁研究院，
类型：发明
国别省市：