一种鱼类卵细胞的高效基因编辑方法技术

本发明专利技术属于鱼类基因编辑领域，公开了一种鱼类卵细胞的高效基因编辑方法，包括如下步骤：对鱼类卵子进行人工假授精预处理；将假受精后的卵子静止观察，选择卵子一端开始出现新月形透明区时进行精准注射基因编辑试剂；将完成注射后的卵子置于室温下静水孵育，继续观察胚胎发育状况，在即将进行第一次卵裂前进行热休克处理，再置于室温下静水孵育直至孵化出苗；对存活的鱼类后代进行观察和DNA测序，分析鉴定出基因编辑成功的个体。该方法可以增加基因编辑时效，提高卵细胞体外编辑效率，操作更简便。简便。简便。

【技术实现步骤摘要】
一种鱼类卵细胞的高效基因编辑方法


[0001]本专利技术属于鱼类基因编辑
，涉及一种鱼类卵的细胞高效基因编辑方法。

技术介绍

[0002]目前，针对鱼类的基因编辑方法主要为受精卵/胚胎基因编辑，获得嵌合体后代。开展卵细胞基因编辑有助于在基因编辑原代获取纯合突变体，缩短分子育种周期，降低育种成本，具有重要的经济价值和社会效应。然而，大多数鱼类卵子外被结构致密的卵外膜，显微进针困难。若采用机械法剥膜或者胰酶消化去膜，不仅难度大、费时费力，对卵子也产生极大损伤，存活率极低。因此需要开发一种便利快捷、高效的鱼类卵细胞基因编辑方法。

技术实现思路

[0003]本专利技术所要解决的技术问题是，克服以上
技术介绍
中提到的不足和缺陷，针对鱼卵细胞基因编辑存在的注射困难的问题，提供一种鱼类卵细胞的高效基因编辑方法。
[0004]为解决上述技术问题，本专利技术提出的技术方案为：
[0005]一种鱼类卵细胞的高效基因编辑方法，包括如下步骤：
[0006]步骤一：对鱼类卵子进行人工假授精预处理；
[0007]步骤二：将假受精后的卵子静止观察，选择卵子一端开始出现新月形透明区时进行精准注射基因编辑试剂；
[0008]步骤三：将完成注射后的卵子置于室温下静水孵育，继续观察胚胎发育状况，在即将进行第一次卵裂前进行热休克处理，再置于室温下静水孵育直至孵化出苗；
[0009]步骤四：对存活的鱼类后代进行观察和DNA测序，分析鉴定出基因编辑成功的个体。
[0010]上述的鱼类卵细胞的高效基因编辑方法，优选的，所述步骤一的人工假授精预处理具体包括如下步骤：选择杂交致死的远缘鱼类品种作为精子来源，异源精子经紫外线照射使其遗传失活后，与成熟卵子混匀并加入清水，完成人工假授精预处理。
[0011]优选的，所述步骤二的精准注射具体包括如下步骤：将假受精后的卵子平铺于琼脂板上，体视镜下观察到卵子一端开始出现新月形透明区时，使用FemtoJet显微注射系统迅速将已经在37℃下孵育5
‑
10min的Cas9蛋白和gRNA的混合物注射到所述新月形透明区内；所述gRNA是以被编辑的基因片段为靶位点设计得到。
[0012]优选的，所述步骤三中，所述热休克处理的温度为41.5
±
0.5℃，处理时间为2min。
[0013]优选的，所述鱼类为斑马鱼，对斑马鱼氨酸酶基因进行高效基因敲除。
[0014]更优选的，具体包括如下步骤：
[0015](1)以斑马鱼酪氨酸酶基因上的靶位点序列设计得到gRNA体外转录模板序列，经体外转录纯化得到的gRNA和Cas9蛋白在注射前5
‑
10min在37℃条件下混合孵育，得到gRNA和Cas9蛋白的混合物，其中，Cas9的浓度为250ng/μL，gRNA的浓度为60～150ng/μL；
[0016](2)选择已达性成熟、健壮、1年龄雄性红鲫作为异源精子来源，挤出红鲫精子稀释
于10倍体积的Hank's溶液中，均匀铺涂在玻璃培养皿上并放置在转速为40
‑
50rpm的摇床上，避光环境下紫外照射2
‑
3min，强度为200
‑
300mJ/cm2，得到遗传失活的精子溶液收集至暗处保存；
[0017](3)挤出斑马鱼成熟卵细胞于玻璃培养皿上，加入所述遗传失活的精子溶液，滴加清水使精子获能激活卵子，完成人工假授精预处理；
[0018](4)将假受精后的卵子平铺于琼脂板上，体视镜下观察到卵子一端开始出现新月形透明区时，使用FemtoJet显微注射系统迅速将所述Cas9蛋白和gRNA的混合物注射到所述新月形透明区内；
[0019](5)将完成注射后的卵子置于室温下静水孵育，继续观察胚胎发育状况，在即将进行第一次卵裂前进行41.5
±
0.5℃热休克处理2min，再置于室温下静水孵育直至孵化出苗；
[0020](6)在28℃水体下培育3天后，将获得的鱼苗在显微镜下观察、DNA提取，对包含酪氨酸酶基因敲除位点的核苷酸片段进行PCR扩增并测序，分析鉴定出基因编辑成功的个体。
[0021]优选的，所述斑马鱼酪氨酸酶基因上的靶位点序列如SEQ ID NO：1所示，所述gRNA体外转录模板序列如SEQ ID NO：2所示。
[0022]优选的，所述PCR扩增采用的上下游引物分别如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示。
[0023]本专利技术的技术原理如下：本专利技术选择合适的异源精子进行紫外照射遗传灭活并进行假授精激活卵子；确认鱼卵可注射的最早的时间点为卵子初始激活状态时卵子一端开始出现新月形透明区，此时早期胚盘刚刚形成，对早期胚盘注射已孵育的Cas9蛋白和gRNA的混合物，并使用热休克“延迟”胚胎发育，延长单细胞阶段基因编辑的时间，抑制第一次卵裂使胚胎二倍化，最后对存活的后代进行观察和DNA测序，分析鉴定出基因编辑成功的个体。
[0024]与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
[0025]本专利技术的方法，用遗传灭活的异源精子对鱼类卵子进行人工假授精预处理，改变卵外膜状态，并利用活化卵子的结构变化，开展精准显微注射；同时利用温度休克对发育的“延迟”影响，增加基因编辑时效，提高卵细胞体外编辑效率。本专利技术所述方法比以往的卵细胞基因编辑方法操作更简便，基因编辑效率得到极大的提高。
附图说明
[0026]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0027]图1是实施例1的斑马鱼酪氨酸酶基因敲除鱼苗；
[0028]图2是实施例1的斑马鱼酪氨酸酶基因敲除测序图；
[0029]图3是实施例1的斑马鱼酪氨酸酶基因敲除纯合子结果。
具体实施方式
[0030]为了便于理解本专利技术，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本专利技术做更全面、细致地描述，但本专利技术的保护范围并不限于以下具体实施例。
[0031]除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相
同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本专利技术的保护范围。
[0032]除非另有特别说明，本专利技术中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
[0033]实施例1：
[0034]一种鱼类卵细胞的高效基因编辑方法，具体是对斑马鱼酪氨酸酶基因进行高效基因敲除，包括如下步骤：
[0035](1)gRNA和Cas9蛋白的混合物制备：以斑马鱼酪氨酸酶基因上的5
′‑
GGACTGGAGG ACTTCTGGGG
‑3′
序列(如SEQ ID NO：本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
NO：2所示。8.根据权利要求6所述的鱼类卵细胞的高效基因编辑方法，其特征在于，所述PCR...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖亚梅，范云鹏，彭亮跃，符文，刘锦辉，刘文彬，
申请(专利权)人：湖南师范大学，
类型：发明
国别省市：