一种RBM15B基因敲除小鼠模型、构建方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种RBM15B基因敲除小鼠模型构建方法及其应用，构建方法包括如下步骤:步骤一、基于CRISPR/Cas9基因敲除技术，确定待敲除RBM15B基因的特异性靶位点gRNA

【技术实现步骤摘要】
一种RBM15B基因敲除小鼠模型、构建方法及应用


[0001]本专利技术属于动物模型构建
，尤其涉及一种RBM15B基因敲除小鼠模型、构建方法及应用。

技术介绍

[0002]N6
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甲基腺嘌呤(N6
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methyladenosine,m6A)修饰是位于腺嘌呤第6位氮原子上的甲基化修饰，是真核生物中分布最广泛的RNA修饰之一。m6A修饰主要由甲基化酶(writers)、去甲基化酶(erasers)和识别蛋白(readers)所调控，参与RNA剪接、出入核、蛋白质翻译及降解等多种生物学过程。近年来研究表明m6A修饰在肾脏肿瘤、糖尿病肾病、顺铂诱导急性肾损伤及狼疮性肾炎等肾脏疾病的发病中起重要调节作用，部分m6A的缺失可直接影响下游基因的转录。RBM15B(RNA结合基序蛋白15B)是一种甲基化修饰酶，是WTAP的共沉淀物，在m6A甲基化位点附近有丰富的RBM15B结合位点。目前m6A修饰作用主要围绕甲基化酶METTL3和METTL14、去甲基化酶ALKBH5、FTO在肾间质纤维化的作用进行，然而，目前对RBM15B甲基化酶是否参与肾间质纤维化及相关疾病的发生发展尚未报道。
[0003]基因敲除动物模型是近年来发展起来的技术，其中CRISPR/Cas9技术(律成簇间隔短回文重复序列)在基因敲除动物模型中应用广泛，其通过导向RNA(sgRNA)介导核酸内切酶Cas9蛋白进行目标DNA序列识别并造成DNA双链断裂，促进以同源重组或非同源末端连接方式修复受损DNA，从而对目标位点实现基因的定点敲除、敲入以及基因修正等多种修饰。目前尚没有关于RBM15B基因敲除小鼠模型构建的相关报道。
[0004]因此，本专利技术旨在提供一种RBM15B基因小鼠模型的构建方法，并进一步提供一种RBM15B基因小鼠模型，从而利于深入了解RBM15B介导的m6A修饰在肾间质纤维化及相关疾病中的作用及具体机制，为进一步指导评估及诊疗提供新思路，并为新药靶点研发提供新方向。

技术实现思路

[0005]本专利技术所解决的技术问题在于提供一种RBM15B基因敲除小鼠模型构建方法及其应用。得到的动物模型可进一步探讨RBM15B基因的生物学功能，及其介导的m6A修饰在肾间质纤维化及相关疾病中的作用及具体机制。
[0006]本专利技术所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：
[0007]一种RBM15B基因敲除小鼠模型构建方法，包括如下步骤:
[0008]步骤一、基于CRISPR/Cas9基因敲除技术，确定待敲除RBM15B基因的特异性靶位点gRNA
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B1和gRNA
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B2，gRNA
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B1的基因序列如SEQ ID NO.1所示，gRNA
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B2的基因序列如SEQ ID NO.2所示；
[0009]步骤二、将有活性的gRNA
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B1、gRNA
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B2、Cas9核酸酶注射入小鼠受精卵中，获得RBM15B基因敲除小鼠。
[0010]进一步地，步骤二包括以下步骤：
[0011]1)将有活性的gRNA
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B1、gRNA
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B2、Cas9核酸酶注射入小鼠受精卵中，待其怀孕产仔获得F0代小鼠；
[0012]2)将步骤1)中获得的F0代小鼠与野生型小鼠交配，获得F1代杂合子；
[0013]3)将步骤2)获得的F1代杂合子小鼠自交获得F2代纯合子小鼠即为RBM15B基因敲除小鼠模型。
[0014]进一步地，步骤2)中，对F1代杂合子小鼠进行PCR鉴定、测序和验证；其中PCR扩增引物包括F1和R1，F1的基因序列如SEQ ID NO.3所示，R1的基因序列如SEQ ID NO.4所示；测序引物的基因序列如SEQ ID NO.5所示。
[0015]进一步地，步骤3)中，对F2代小鼠及后期繁殖的小鼠进行PCR鉴定确定其基因型，PCR扩增引物组合包括F1、R1和F2，其中F1的基因序列如SEQ ID NO.3所示，R1的基因序列如SEQ ID NO.4所示，F2的基因序列如SEQ ID NO.5所示。
[0016]进一步地，PCR反应条件为：
[0017]预变性：94～95℃的条件下处理3min；、
[0018]变性：94～95℃的条件下处理30s；
[0019]退火：55～65℃的条件下处理35s；
[0020]延伸：70～74℃的条件下处理35s；
[0021]再延伸：70～74℃的条件下处理5min；
[0022]循环次数为32～35次。
[0023]采用所述的RBM15B基因敲除小鼠模型构建方法构建的RBM15B基因敲除小鼠模型。
[0024]所述的RBM15B基因敲除小鼠模型在肾间质纤维化、肿瘤和炎症中的应用。
[0025]有益效果：本专利技术所述的RBM15B基因敲除小鼠模型构建方法，其基于CRISPR/Cas9技术，聚焦于RBM15B基因的1号外显子，通过设计特异性靶位点gRNA
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B1和gRNA
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B2，结合Cas9核酸酶注射至小鼠受精卵内后，可以实现RBM15B基因的全身性敲除，其敲除效率高、脱靶率低，RBM15B基因敲除小鼠模型的构建的成功率高。
[0026]本专利技术构建的RBM15B基因敲除小鼠模型构建方法，其通过独特设计的PCR扩增序列和测序序列，从而成功对F0代小鼠和F1代杂合子的基因进行确定，进一步提高RBM15B基因敲除小鼠模型的构建的成功率。
[0027]本专利技术所述的RBM15B基因敲除小鼠模型，利于进一步探讨RBM15B基因的生物学功能，利于进一步研究RBM15B基因介导的m6A修饰在肾间质纤维化及相关疾病或其它疾病中的作用及具体机制，为新药靶点研发提供新方向。
附图说明
[0028]图1为本专利技术提供的KO区域4种碱基的比率分布图。
[0029]图2a为本专利技术提供的KO区域上游2000bp序列与小鼠基因组进行BLAST比对的相似性分析结果示意图。
[0030]图2b为本专利技术提供的KO区域下游2000bp序列与小鼠基因组进行BLAST比对的相似性分析结果示意图。
[0031]图3为本专利技术的F1代RBM15B基因敲除靶位构建图。
[0032]图4为敲除杂合子鼠的RBM15B基因敲除位点的基因型检测。
[0033]图5为本专利技术的F2代RBM15B基因敲除靶位构建图。
具体实施方式
[0034]为了使本专利技术实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例进一步阐述本专利技术。
[0035]实施例1
[0036]一种RBM15B基因敲除小鼠模型构建方法，包括如下步骤:
[0037]步骤一：基于CRISPR/Cas9基因敲除技术，确定待敲除RBM15B基因的特异性靶位点gRNA...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种RBM15B基因敲除小鼠模型构建方法，其特征在于，包括如下步骤:步骤一、基于CRISPR/Cas9基因敲除技术，确定待敲除RBM15B基因的特异性靶位点gRNA
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B1和gRNA
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B2，gRNA
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B1的基因序列如SEQ ID NO.1所示，gRNA
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B2的基因序列如SEQ ID NO.2所示；步骤二、将有活性的gRNA
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B1、gRNA
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B2、Cas9核酸酶注射入小鼠受精卵中，获得RBM15B基因敲除小鼠。2.根据权利要求1所述的RBM15B基因敲除小鼠模型构建方法，其特征在于，步骤二包括以下步骤：1)将有活性的gRNA
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B1、gRNA
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B2、Cas9核酸酶注射入小鼠受精卵中，待其怀孕产仔获得F0代小鼠；2)将步骤1)中获得的F0代小鼠与野生型小鼠交配，获得F1代杂合子；3)将步骤2)获得的F1代杂合子小鼠自交获得F2代纯合子小鼠即为RBM15B基因敲除小鼠模型。3.根据权利要求2所述的RBM15B基因敲除小鼠模型构建方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：覃娇，文锐，谭湘凌，彭雄群，谢和宾，苏英杰，丁宁，
申请(专利权)人：长沙市中心医院，
类型：发明
国别省市：