MTHFR基因修饰小鼠的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种MTHFR基因修饰的小鼠的制备方法，所述的小鼠表达突变的MTHFR蛋白，所述的突变的MTHFR蛋白包含MTHFR基因的第215

【技术实现步骤摘要】
MTHFR基因修饰小鼠的制备方法及其应用


[0001]本专利技术涉及一种基因编辑的动物模型构建方法及其应用，具体而言涉及一种MTHFR基因点突变小鼠的构建方法及应用。

技术介绍

[0002]叶酸在体内可通过甲基化和转硫两种方式代谢，参与代谢的亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)、甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)等基因具有多态性，使得人体在补充叶酸后，体内叶酸的活性产物浓度存在差异。编码MTHFR的基因定位于1号染色体lp36.3位置，有11个外显子，且具有多态性。该还原酶在叶酸代谢通路中将5,10
‑
亚甲基四氢叶酸还原为5
‑
甲基四氢叶酸，后者也是血液循环中叶酸的唯一形式，被细胞吸收并利用。1995年Frosst等首次发现MTHFR:677C＞T突变，导致其对热不稳定，奠定MTHFR不同基因型活性存在差异的理论基础。MTHFR677位点有3种基因分型，野生型CC，杂合突变型CT，纯合突变型TT，有研究显示中国人群中，约29％人MTHFR基因为677TT型。
[0003]目前，关于MTHFR677基因多态性与疾病的相关性研究较多，其中包括银屑病、糖尿病及糖尿病有关的精神病变、急性冠脉综合征、高血压、不孕不育、卒中与精神疾病、癌症等。已知MTHFR677TT基因型对人类健康造成负面影响，因此难以解释其在人类中高比例的存在。该基因可能具体某些独特的性质，也能对人类具有某些正面作用。一份研究表明，MTHFR677TT可能在膳食叶酸供应不足的时期提供了对巨幼细胞性贫血的保护[Green R,Miller JW.Folate deficiency beyond megaloblastic anemia:hyperhomocysteinemia and other manifestations of dysfunctional folate status.Semin Hematol.1999；36(1):47
‑
64.]。也有学者指出有关基因的突变可能有组于抵抗疟疾感染[Meadows DN,Pyzik M,Wu Q,et al.Increased resistance to malaria in mice with methylenetetrahydrofolate reductase(Mthfr)deficiency suggests amechanism for selection of the MTHFR 677C>T(c.665C>T)variant.Hum Mutat.2014；35(5):594
‑
600.]。
[0004]一个良好的动物模型能够帮助人们发现并研究677TT有关的疾病的病理，并找到有关的药物。在2001年Chen等人利用胚胎干细胞途径的基因打靶技术，实现了在小鼠MTHFR基因的第三外显子插入了新酶素磷酸转移酶(neo)的基因，破坏了MTHFR酶的活性[Chen Z,Karaplis AC,Ackerman SL,et al.Mice deficient in methylenetetrahydrofolate reductase exhibit hyperhomocysteinemia and decreased methylation capacity,with neuropathology and aortic lipid deposition.Hum Mol Genet.2001；10(5):433
‑
443.]。作为一种经典的MTHFR基因缺陷小鼠，被人们广泛应用。然而虽然上述模型产生了轻度的MTHFR缺乏症的小鼠，但是与人类的677TT情况并不一致，绝大部分的677TT人群与正常人群均能正常生活，相关基因突变并不能显著影响健康。因此需要一种与上述情况更接近的工具，以研究并开发有关药物。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的之一是提供一种MTHFR基因点突变小鼠的构建方法，所述小鼠表达突变的MTHFR蛋白，所述突变的MTHFR蛋白包含SEQ ID NO:17所示MTHFR基因的第221位氨基酸突变，所述的氨基酸突变为Ala突变为Val，相对应的碱基由GCC变为GTC，所述方法包括使用基因编辑的技术将突变基因敲入MTHFR基因的靶目标序列。
[0006]本专利技术使用基因编辑技术进行MTHFR特定位点的进行基因敲入，所述的基因编辑技术为CRISPR/Cas9技术。
[0007]优选的所述构建方法包括使用sgRNA和/或打靶载体将序列插入MTHFR基因座。
[0008]优选的，所述sgRNA3
’
末端包含PAM序列，进一步优选的，所述PAM序列可以为GGG、TGG、AGG。
[0009]进一步优选的，所述sgRNA的底链寡核苷酸与SEQ ID NO.1
‑
16任一项具有80％以上的同源性或者包含SEQ ID NO.1
‑
16任一项所示的核苷酸序列。
[0010]本专利技术所述的构建方法还包含初代基因编辑鼠与野生型交配获得具有稳定基因型小鼠的方法。
[0011]优选的，所述构建方法包含以下步骤：
[0012]1)将序列如SEQ ID NO.1
‑
16所示的任一项或多项sgRNA靶序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列；
[0013]2)通过Gibson Assembly的方式将sgRNA序列相应引物连入pCS质粒载体构建Cas9/sgRNA质粒；
[0014]3)将上述Cas9/sgRNA表达载体连入带T7启动子质粒载体上进行体外转录得到注射用RNA；
[0015]4)将上述体外转录产物注射至小鼠细胞，所述细胞为受精卵细胞或者胚胎干细胞；
[0016]5)将步骤4所述细胞在培养后移植至雌性小鼠的输卵管中发育，之后鉴定发育后小鼠基因修饰情况，进行筛选并种系传递。
[0017]本专利技术的另一个目的是提供一种类似人类MTHFR677TT的小鼠模型的应用，所述应用包括：1、涉及MTHFR基因的产品开发中的应用；2、作为毒理学、药理学、免疫学和医学研究的模型系统中的应用；3、涉及叶酸代谢药物的筛选、药效检测、评价的应用；4、研究MTHFR基因或蛋白功能的应用。
[0018]本专利技术的第三个目的是提供一种靶向MTHFR基因的sgRNA分子。
[0019]优选的，所述sgRNA分子序列如SEQ ID NO.1
‑
16所示。
[0020]进一步优选的，所述sgRNA分子序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:13所示。
[0021]本专利技术的第四个目的是提供一种MTHFR基因修饰的细胞或细胞株，所述细胞或细胞株中至少有一个染色体包含编码突变的MTHFR蛋白的MTHFR基因，所述细胞来自使用本专利技术所述sgRNA分子基因编辑或本专利技术所述点突变小鼠细胞。
[0022]本专利技术所述的细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种MTHFR基因修饰的小鼠的制备方法，其特征在于，所述的小鼠表达突变的MTHFR蛋白，所述的突变的MTHFR蛋白包含SEQ ID NO:17所示MTHFR基因的第215
‑
225位任意一个或多个氨基酸突变的氨基酸序列所表达的蛋白。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述突变的MTHFR蛋白为MTHFR基因的第221位氨基酸突变的氨基酸序列表达的蛋白，进一步优选所述的氨基酸突变为Ala突变为Val，相对应的碱基由GCC变为GTC。3.根据权利要求1
‑
2任一所述的制备方法，其特征在于，所述MTHFR基因修饰的小鼠为通过在小鼠内源MTHFR基因座处引入1个或多个突变制备获得。4.根据权利要求1
‑
3任一所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括使用基因编辑的技术将突变基因敲入MTHFR基因的靶目标序列，优选的，基因编辑技术为CRISPR/Cas9技术，优选的所述制备方法包括使用sgRNA和/或打靶载体将序列插入MTHFR基因座。5.根据权利要求1
‑
4任一所述的制备方法，所述的MTHFR基因修饰小鼠制备方法为使用sgRNA和/或靶向载体将小鼠MTHFR基因座的第215
‑
225处氨基酸序列引入一个或多个点突变制备获得；所述的sgRNA靶向的靶位点序列如SEQ ID NO：1
‑
16任一项所示。6.一种制备MTHFR基因修饰的小鼠的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1)将序列如SEQ ID NO.1
‑
16所示的任一项或多项sgRNA靶序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列；2)通过Gibson Assembly的方式将sgRNA序列相应引物连入pCS质粒载体构建Cas9/sgRNA质粒；3)将上述Cas9/sgRNA表达载体连入带T7启动子质粒载体上进行体外转录得到注射用RNA；4)将上述体外转录产物注射至小鼠细胞，所述细胞为受精卵细胞或者胚胎干细胞；5)将步骤4所述细胞在培养后移植至雌性小鼠的输卵管中发育，之后鉴定发育后小鼠基因修饰...

【专利技术属性】
技术研发人员：成永之，连增林，
申请(专利权)人：连云港金康和信药业有限公司，
类型：发明
国别省市：