本发明专利技术提供了一种青蒿转基因育种方法，是以未成熟青蒿花序为外植体，用携带有外源基因的农杆菌菌液侵染外植体，经过2-3天的共培养，将外植体放置在加有选择压的培养基上诱导产生愈伤组织，进一步诱导成再生植株，再通过对报告基因的分子生物学检测，从再生植株中鉴定出转化植株。本发明专利技术用青蒿的未成熟花序作为外植体,与农杆菌EHA105菌株共培养具有更高的转化率，最高转化率为17.2％，比目前青蒿转基因中常用的叶片外植体转化率高8.59％。本发明专利技术不仅为青蒿遗传转化提供了一个新的转化系统，而且也为其他难以进行农杆菌转化的植物种提供了借鉴。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因育种，具体属于。
技术介绍
疟疾是一种严重危害生命疾病，每年全世界大约有一百万人死于疟疾，并每年大 约有 350-500 万新增病例（Grahametal. 2010;Grahametal. 2010;MilhousandWeina 2010)〇 长期以来，青蒿就是一种用来治疗疟疾的特效药用植物。青蒿素是一种倍半萜 烯内酯内过氧化物，是目前公认最有效的抗耐多药恶性疟原虫的化合物（Weina2008;Li etal.2006)。青蒿素还具有治疗某些癌症和其他病毒性疾病和寄生虫病的能力（Efferth 2007;Efferthetal.2008;Weathersetal.2011) ?然而，由于青蒿植物中低青蒿素含量 (占干重0.01%-0.8%)。以青蒿素为基础药物的应用受到了限制，特别是在发展中国 家（Nairetal. 1986;Klayman1985)。同时，青蒿素由于结构非常复杂，一直未能实现全 化学合成。虽然部分化学合成青蒿素已经实现，但是它成本较高，无法推广应用（Haynes， 2006年）。目前，青蒿素的大量生产仍是基于提高栽培青蒿中青蒿素的含量。所以，利用 青蒿转基因技术选育高青蒿素含量的新品系将对于青蒿素的大量生产将会起到积极作用。 青蒿转基因工作开始于1996年和1997年，所用方法是农杆菌介导法（Banerjee etal. 1997;Vergauweetal. 1996年）。从那时起，研宄者在青蒿的转基因方法上做了大 量的工作，然而收效甚微。许多研宄证明，青蒿转基因是非常困难的，因为它费力、耗时，更 重要的是转化效率很低（低于10%)(Liuetal.2011年）。一些研宄报道证明，青蒿的转 化效率明显受到外植体类型、土壤农杆菌菌株，外植体的年龄等因素的影响（Teixeirada Silva2003;Vergauweetal. 1998;Ghoshetal. 1997)。因此，高效的青蒿转基因技术是 青蒿育种迫切需要的。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种转化效率较高的青蒿转基因育种方法。 本专利技术提供的，是以未成熟青蒿花序为外植体，用携带 有外源基因的农杆菌菌液侵染外植体，经过2-3天的共培养，将外植体放置在加有选择压 的培养基上诱导产生愈伤组织，进一步诱导成再生植株，再通过对报告基因的分子生物学 检测，从再生植株中鉴定出转化植株。 具体包括如下步骤： 1)取田间生长的青蒿未成熟花序作为外植体，用50%次氯酸钠溶液消毒，用无菌 蒸馏水冲洗5次，并切成l-2cm的切段，然后置于携带有质粒pCaMBIA2301的农杆菌菌液中 浸泡5-30分钟，取出后用无菌滤纸去除多余的菌液，将其转移至共培养基上，培养2-3天； 然后将外植体转入添加了选择压的诱导培养基中培养，直到诱导出愈伤组织和抗性芽苗， 在诱导培养阶段，每隔4周继代培养一次； 2)将生长至2-3个叶片的绿色抗性芽苗转移到生根培养基中培养，诱导抗性芽苗 生根，即成抗性再生植株。 所述的农杆菌为根癌农杆菌，菌株为EHA105或LBA4404,优选EHA105。 所述的农杆菌菌液浓度为0D_0. 2-0. 6。 所述的培养的温度维持在25±2°C，培养的光照周期为光照16h、黑暗8h。 所述的共培养基为：以MS为基本培养基，添加0. 5mg/L6-苄基腺嘌呤、0. 3mg/L 萘乙酸，30g/L蔗糖和6g/L琼脂，pH为5. 4-5. 8 ; 所述的诱导培养基为：以MS为基本培养基，添加0. 5mg/L6-苄基腺嘌呤、0. 3mg/ L萘乙酸，30g/L蔗糖，300mg/L头孢霉素，20mg/L卡那霉素和6. 5g/L琼脂，pH为5. 4-5. 8 ; 所述的生根培养基为：以MS为基本培养基，添加0. 2mg/LNAA，30g/L蔗糖，300mg/ L头孢霉素，10mg/L卡那霉素和6. 5g/L琼脂，pH为5. 4-5. 8。 本专利技术采用青蒿花序作为外植体进行转基因育种的方法，同样适用于其它植物花 序作为外植体进行转基因育种。 与现有技术相比，本专利技术具有如下优点和有益效果： 1)与目前常规的农杆菌介导的青蒿转基因方法相比，本专利技术利用未成熟花序诱导 转化细胞产生愈伤组织，并利用抗生素对转化细胞进行初步筛选，保证了转化愈伤组织的 均一性。 2)本专利技术用青蒿的未成熟花序作为外植体，与农杆菌EHA105菌株共培养具有更 高的转化率，最高转化率为17. 2%。 3)本专利技术不仅为青蒿遗传转化提供了一个新的转化系统，而且也为其他难以进行 农杆菌转化的植物种提供了借鉴。【附图说明】 图lpCaMBIA2301质粒物理图谱 图2未成熟花序外植体转化后抗性芽苗分化、生长情况，其中，A:抗性芽苗分化， B:抗性芽苗生长。 图3转基因植株和未转基因的对照植株Southern印迹杂交分析，其中，M:为分子 量标记；1-7分别为不同的转基因植株六1'-3、六1'-10、六1'-16、六1'-23、六1'-27、六1'-32和六1'-37; 8为未转基因的对照植株；9为质粒pCaMBIA2301作为阳性对照。【具体实施方式】 实施例1 以青蒿品种'酉阳1号'为受体进行转基因实验。 1 ?试验方法： (1) 土壤农杆菌菌株培养 农杆菌菌株EHA105,购于上海迈其生物科技有限公司。农杆菌菌株LBA4404和 pCaMBIA2301 (图1)质粒均购于北京鼎国昌盛生物技术有限公司。质粒pCaMBIA2301包含 ⑶S基因，该基因受花叶病毒35S启动子和NOS终止子调控。pCaMBIA2301 (图1)质粒用冻 融法分别转入到农杆菌EHA105菌株和LBA4404菌株中。 携带有pCaMBIA2301质粒的农杆菌EHA105菌株和LBA4404菌株，分别接种在含 有50mg/L卡那霉素，50mg/L利福平的20mLYEB培养基中。培养瓶放置在28°C恒温培养箱 中过夜培养。之后取200yL培养液转接到含有50mg/L卡那霉素，50mg/L利福平的50mL YEB的无菌液体培养基中，培养温度保持在28 °C，震荡培养转速为250rpm，培养到OD6tltl达到 了 0. 2时，将农杆菌培养物在4000g条件下离心5分钟。去除原先的培养基，用相同体积， 未加琼脂的共培养基将农杆菌沉淀物重新悬浮，制备成农杆菌菌液。 (2)植物转化和再生 在青蒿生长季取未成熟的花序作为外植体，用当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种青蒿转基因育种方法，其特征在于，包括如下步骤：1)取田间生长的青蒿未成熟花序作为外植体，用50％次氯酸钠溶液消毒，用无菌蒸馏水冲洗5次，并切成1‑2cm的切段，然后置于携带有质粒pCaMBIA2301的农杆菌菌液中浸泡5‑30分钟,取出后用无菌滤纸去除多余的菌液，将其转移至共培养基上，培养2‑3天；然后将外植体转入添加了选择压的诱导培养基中培养，直到诱导出愈伤组织和芽苗，在诱导培养阶段，每隔4周继代培养一次；2)将生长至2‑3个叶片的绿色芽苗转移到生根培养基中培养，诱导芽苗生根，即成再生植株；所述的共培养基为：以MS为基本培养基，添加0.5mg/L 6‑苄基腺嘌呤，0.3mg/L萘乙酸，30g/L蔗糖和6.5g/L琼脂，pH为5.4‑5.8；所述的诱导培养基为：以MS为基本培养基，添加0.5mg/L 6‑苄基腺嘌呤、0.3mg/L萘乙酸，30g/L蔗糖，300mg/L头孢霉素，20mg/L卡那霉素和6.5g/L琼脂，pH为5.4‑5.8；所述的生根培养基为：以MS为基本培养基，添加0.2mg/L NAA,30mg/L蔗糖,300mg/L头孢霉素,10mg/L卡那霉素和6.5g/L琼脂，pH为5.4‑5.8。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王景雪，
申请(专利权)人：山西大学，
类型：发明
国别省市：山西;14
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