一种快速获得大量转基因植物新品种的分子育种方法技术

一种快速获得大量转基因植物新品种的分子育种方法，包括（１）制备外植体；（２）所述外植体在含２．０ｍｇ／Ｌ２，４－Ｄ和０．０２５ｍｇ／Ｌ激动素的ＭＳＨ培养基上预培养之后，用含目标基因的农杆菌菌液侵染外植体，其中所述ＭＳＨ培养基的基本组分包括ＳＨ大量元素，ＭＳ微量元素及铁盐，１－２ｍｇ／Ｌ水解酪蛋白，９．９ｍｇ／Ｌ　　ＶＢ↓［１］，９．５ｍｇ／Ｌ　　ＶＢ↓［６］，４．５ｍｇ／Ｌ尼克酸，８ｇ／Ｌ琼脂和３０ｇ／Ｌ蔗糖；（３）在含除菌药剂浓度逐渐升高的选择压的所述培养基上筛选抗性愈伤组织并除去农杆菌；（４）在含０．３－０．６ｍｇ／Ｌ激动素和低浓度选择压的所述培养基上诱导愈伤组织体细胞胚；（５）体细胞胚萌发，并利用标记基因和目标基因所对应的药剂来筛选抗性转基因再生苗；（６）对转化后获得的抗性苗进行分子检测；（７）扩大繁殖抗性转基因再生苗；（８）对抗性转基因再生苗进行生物学鉴定，获得优良品系。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及利用农杆菌介导的遗传转化、拟转化植物的高频植株再生体系和再生植株的目标抗性筛选三者相结合培育新品种(系)的方法，属于生物

技术介绍
植物遗传转化(genetic transformation)是把外源核苷酸片段转入植物组织、细胞使外源DNA能够保留、表达、并能够传递给后代的技术。它是伴随着分子生物学和植物细胞组织培养技术不断发展，在70年代中期才兴起的一门新技术，在近20年来发展十分迅速。自1985年，Adang等人报道了B.t基因成功导入烟草，并且，外源基因在转基因烟草基中表达(Gene，1985，36289～300.)，现在转基因植物已扩展到经济作物、粮食作物、蔬菜、花卉、药用植物、水果、树木以及牧草等在内的35个属，120多个物种。现在，一些经基因工程改良(或培育)的作物新品种如番茄、油菜、烟草、西葫芦、亚麻、玉米、大豆和棉花都已经实现了商品化，涉及的性状包括品质改良、抗虫、抗除草剂、抗病性的改良等(王国英，1998，科学，50，538～40)。但是，在某些物种上生物技术育种却进展缓慢，其主要原因通常是没有建立合适的相关物种的高效遗传转化的技术体系，而该技术体系中高频的植株再生体系是实现遗传改良的关键。通过基因工程技术对苜蓿进行遗传改良是近年来生物技术在牧草分子育种中的主要应用领域。其主要原因是，苜蓿素有“牧草之王”之称，是世间各国发展畜牧业的首选草种。另外，苜蓿蛋白含量高，是作为植物生物反应器生产疫苗等功能蛋白的优良植物材料。早在1986年，MariaDeak(Plant Cell Reports，597～100)就利用农杆菌介导法将NPT-□基因导入苜蓿的幼嫩茎段，并得到转基因植株，实现了对苜蓿的遗传转化。1988年，Mireille等人(Plant Cell Reports，7512～516)将卡那霉素抗性基因用农杆菌侵染法导入紫花苜蓿叶片受体细胞。之后，借助多种转化方法对苜蓿的遗传转化的研究的报道也较多，也取得了不少成果。Halluin(CropSci，1990，30866～871)借助农杆菌将抗除草剂基因转化苜蓿获得成功，Hill等人(Bio/Technology，1991，9373～377)利用农杆菌将Bt毒蛋白基因导苜蓿获得成功。2000年，我国吕德扬(遗传学报，27，4331～337；中国科学，4，8342～348)报道了国内首例转基因苜蓿再生的研究，但仅得到11株转基因再生苗。这对苜蓿的高效遗传转化并进行改良是不够的。综观国内外生物技术在苜蓿遗传改良上的应用，转化后再生苗获得效率低是制约其发展的主要问题。抗性愈伤多数在40％之内，而抗性愈伤的分化率也仅为1～5％，这严重影响了苜蓿生物技术育种的发展。因此，建立完备的苜蓿生物技术分子育种体系是必要的。本专利技术就是针对
技术介绍
的不足和缺陷，解决了苜蓿再生难的问题，完善了苜蓿的再生体系和遗传转化体系，大幅度提高了苜蓿的转基因再生植株的获得率，为苜蓿的分子育种奠定了坚实的基础。另外，通过特定的实验设计，使苜蓿遗传转化后抗性愈伤的获得率达到50％以上，抗性愈伤的体细胞胚的发生率达到85％以上，抗性再生苗的阳性率达到80％以上，并直接获得具有目标基因抗性的再生苗系。通过在遗传转化过程中进行优良株系的选择，并扩繁，加快了优良转基因新品种的获得。具有一定的社会效益和经济效益，可应用于我国的牧草改良。本专利技术的优点(1)时间短，操作简单，可以方便地对苜蓿进行遗传改良。(2)转化效率高，抗性再生苗多，可提供大量的转基因个体供随后选择。(3)解决了特异性状优良植株的快速繁殖问题，可以快速提供大量的优良性状的株系苗，不必通过传统种植方式获得种子就可以进行优良品种(系)选择，加速了育种进程。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种通过生物技术措施对苜蓿进行遗传改良的方法，从而实现苜蓿的高效生物技术育种，以便从多方面提高苜蓿的抗性和改善品质，并为利用苜蓿做生物反应器生产疫苗或是其它功能蛋白提供技术支持。主要技术指标是苜蓿遗传转化后抗性愈伤的获得率为50％以上，筛选后获得的抗性愈伤的分化率为85％以上，再生苗获得时间为10周左右，其中转基因苗获得率为80％以上。其主要内容包括适宜于苜蓿再生的基本培养基，愈伤组织的诱导及保持培养基的配比，体细胞胚诱导及萌发，农杆菌转化和抗性愈伤组织的获得，抗性愈伤组织体细胞的诱导，抗性体细胞胚的萌发及转基因抗性再生苗的筛选和获得，抗性再生苗的分子检测和扩大繁殖，小区模拟抗性试验等。在本专利技术中，术语“目标基因”表示编码特定蛋白，指导植物生物学特性的基因，如植物的抗旱、抗虫、抗涝、花色、高矮等基因。术语“选择压”表示在获得转基因再生苗的过程中要通过一定浓度筛选药剂的筛选，筛选药剂的浓度就是选择压，药剂的浓度高低反应选择压的高低。术语“标记基因”表示指在转基因过程中，为获得目标基因标记性状的转基因植物，用来辅助选择的基因称为标记基因。标记基因常为抗性基因，带有标记基因的细胞、组织、器官、植物体对特定药剂抗性强。术语“抗逆性基因”表示编码特定的在植物体内渗透调节起作用的小分子物质或是编码促使细胞膜稳定物质的基因，其功能是植物对逆境胁迫有较强的耐受性。抗逆性基因包括使植物的抗旱性、抗冻性、抗涝性、抗虫性等提高的基因。如HVA1基因，使植物的抗旱性提高，属于抗旱基因，rstB基因可使植物的耐盐性提高，属抗盐基因。目前发现的其它与植物的抗性相关的基因还有甜菜碱合成酶基因、山梨醇合成酶基因、SOD家族基因、SOS家族基因等。本专利技术提出的一种快速获得大量转基因植物新品种的方以紫花苜蓿苜蓿为例说明。快速获得紫花苜蓿大量转基因植物新品种及其高效遗传转化的分子育种方法，包括以下几个步骤(1)苜蓿外植体制备选取具优良生物学性状的紫花苜蓿鲜嫩材料(子叶、下胚轴、叶片、叶柄、根等)为外植体。子叶、下胚轴等外植体可以通过无菌苗来获得。选取优良紫花苜蓿品种的饱满种子在75％的酒精中浸泡2min，然后用0.1％的氯化汞溶液中消毒10min，再用无菌水冲洗3-5次，接种于1/2MS培养基上发芽获得无菌苗。一周后即可取子叶、下胚轴等做外植体。(2)预培养和农杆菌侵染无菌苗形成后，取子叶横向切成1mm宽的小条，下胚轴切成2-4mm长的小段，接种到改良的SH培养基MSH(以SH(Sckenk & Hilderebrantdt 1972 Can J Bot，50199-204)大量元素+MS(Murashige & Skoog medium，1962，Physiol.Plant 15473-497)微量元素及铁盐+水解酪蛋白1～2mg/L+VB19.9mg/L+VB69.5mg/L+尼克酸4.5mg/L+琼脂8g/L+30g/L蔗糖为基本成分的培养基，pH 5.8，以下相同)附加2.0mg/L 2，4-D和0.025mg/L激动素(kinetin，KT)预培养1～2天。将带有目标基因的农杆菌菌液(农杆菌菌株为LBA4404，购于鼎国生物公司)，目标基因连在真核表达载体质粒3301(ppt抗性)，质粒1301(潮霉素抗性)和质粒pBI121(卡那霉素抗性)(以上质粒均购于clontech生物公司)上，用MSH附加本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王涛，张万军，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：