一种鱼类转基因育种的方法技术

一种鱼类转基因育种的方法，属于分子生物学鱼类育种技术领域。本发明专利技术主要将某种鱼类本身的基因组ＤＮＡ经过预处理，获得有别于原基因组ＤＮＡ的ＤＮＡ重排片断，用转基因的方法将ＤＮＡ重排片断导入原种鱼类的卵细胞中，和原种鱼类的基因组发生作用，形成变异的基因，并产生外形突变的个体，从中可以筛选生产性状优良的个体，进行进一步选育。并用目标区域扩增多态性（ＴＲＡＰ）方法判断ＤＮＡ重排片断是否进入原种鱼类的基因组，并用两步扩增法获得变异的基因，为以后进行功能基因组研究提供一个基础，同时获得独特的分子标记。本发明专利技术方法简单，可广泛应用于鱼类以及其他动植物等育种和相关功能基因组的研究中。

【技术实现步骤摘要】

，属于分子生物学鱼类育种
本专利技术主要将某种鱼类本身的基因组DNA经过预处理，获得有别于原基因组DNA的 DNA重排片断，用转基因的方法将DNA重排片断导入原种鱼类的卵细胞中， 和原种鱼类的基因组发生作用，形成变异的基因，并产生外形突变的个体，从 中可以筛选优良的个体，进行进一步选育。并用目标区域扩增多态性(TRAP) 方法判断DNA重排片断是否进入基因组，用两步扩增法获得变异的基因。为以 后进行功能基因组5开究提供一个基础，同时获得独特的分子标记。
技术介绍
将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达， 引起生物体的性状的可遗传的修饰，这一技术称之为转基因技术。由于生物组 织的复杂性，导入的基因序列会遇到很多问题，如整合，表达，基因沉默等， 更重要的是这些基因在生物体中到底有什么功能，以及它们的调控机制很难完 全搞明白，因此很难得到预期的结果。也就是说尽管导入的是已知序列的基因 也难预知结果如何。异源总DNA导入动植物以获得具有新性状的品系是一种在实践上很有效的 方法。通过该方法获得新的品系的种类最近几年在中国有报道的在植物方面有 小麦，玉米，水稻，马铃薯等。在动物方面也有一定的应用，如中科院水生 所刘汉勤等人采用精子载体的方法将鲫鱼肝总DNA转入红鲤体内，后代中有 0.69%的个体体色中产生了鲫鱼黑色素。1997年章怀云等人将草鱼精子与红鲤 鱼肝脏总DNA共培养，获得了体形、体色变异的个体。和转特定基因相比，异源总DNA导入动植物可以获得大量形态各异的突变 体，可供研究者进行下一步选育。而且由于大部分真核生物的基因组有大量的 非编码序列，这些序列的功能如何我们并不知道，而异源总DNA导入法对这些 非编码区域的序列也进行了筛选。但前提就是要知道哪些序列进入了基因组。 通过RAPD和Southem杂交人们找到一些区别于宿主的条带，但是都没有进一步 的研究报道，很难让人相信这些条带是否一定是导入的外源序列，因此这个方 法受到广泛的质疑。关于该异源总DNA导入方法的理论基础，1974年周光宇提出了染色体水平 以下的DNA片段杂交假说，认为异源总DNA导入导致的外型变化是在母本染色 体基础上添加了交换的远缘DNA片段的结果。这一假设为高粱稻及其亲本的同工酶酶谱分析及DNA杂交的复性动力学初步证实。但是由于没有合适的技术跟 踪这些外源DNA，所以以上假设没有最直接的证明。异源总DNA导入鱼类最难解决的问题就是如何跟踪进入细胞核的外源序 列。由于大部分外源DNA片断进入基因组最终是被降解的，但具体过程并没有 深入研究的报道。所以我们必须找到一个方法可以降低导入外源DNA的降解。 根据这几年转基因研究的结论，越接近宿主序列的基因越倾向于保留。所以我 们设想如果将鱼类本身的基因组片断改变次序再导入原种鱼类的卵细胞，研究 其是否能被保留，并对原基因组产生影响，产生突变型。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一个新的方法和思路，利用鱼类本身的基因组DNA， 经过预处理，形成新的DNA片断(DNA重排序列)，同时利用设计好的接头作为 跟踪序列，利用转基因的方法导入原种鱼类，对基因组进行干扰，形成变异基 因和外形上的变化，同时设计两步扩增法获得DNA重排序列，以解决以往外源 总DNA导入法所无法了解的哪些序列进入宿主导致突变型的产生。本专利技术还涉及一种简单的获得鱼类突变体的方法。本专利技术还涉及鱼类育种中获得新选育突变个体的方法。本专利技术还涉及很多功能序列的寻找。本专利技术还涉及获得的鱼类新品系的相关分子标记的获得。本专利技术的技术方案 ，将某种鱼类本身的基因 组DNA经过预处理，成为一种有别于原基因组DNA的DNA重排片断，用转 基因的方法将DNA重排片断导入原种鱼类的卵细胞中，和原种鱼类的基因组发 生作用，形成变异的基因，并产生外形突变的个体，从中筛选生产性状优良的 个体，进行进一步选育；通过设计好的扩增固定引物gmprimer 2对这些突变个体基因组进行扩增， 用目标区域扩增多态性TRAP方法判断DNA重排片断是否进入突变个体的基因 组，设计两个引物gmprimerl和gmprimerl+l:用两步扩增法获得变异的基因， 作为鉴定这些突变个体的分子标记；所述某种鱼类本身的基因组DNA预处理方法提取某种鱼类的基因组DNA，先用限制性内切酶^fe^I酶切反应，反应完 成后用反应体系2倍体积的乙醇沉淀，12000转离心，吹干乙醇后，重新连接， 连接反应结束后用2倍体积的乙醇沉淀，12000转离心，吹干乙醇后，再用限制 性内切酶五co及I酶切，用2倍体积的乙醇沉淀，12000转离心，吹干乙醇后， 加入跟踪接头序列gmadaptorl连接，用2倍体积的乙醇沉淀，保存。基因组DNA预处理方法，跟踪接头序列为gmadaptorl: cgagcaggac tcatgatcct cgtagactgc gtacc; aattggtacg cagtctacga ggatcatgag tcctgct。TRAP的扩增固定引物为gmprimer2: cagtctacga ggatcatgag tcctgct。 为得到用两步扩增法获得变异的基因所设计的两个引物为 gmprimer 1: actcatgatc etcgtagact gcgtacc; gmprimer 1+h atcctcgtag actgcgtacc aattn 。鱼类本身的基因组DNA预处理方法，其他识别位点为四个碱基的限制性内 切酶都能代替限制性内切酶I用于酶切反应。本专利技术的有益效果目前， 一般采用的鱼类转基因育种方法为异源总DNA 导入法，但无法跟踪导入序列，本专利技术采用将一种鱼类本身的基因组用一种限 制性内切酶切断，重新连接，再换一种限制性内切酶酶切，得到的新片断完全 来自该种鱼类，可以在该种鱼类的基因组中找到同源序列，但由于二次连接后 次序被打乱，又不完全是该种鱼类原来的序列。研究证明这样的序列更容易被 保留，并对该种鱼类的基因组产生影响，产生突变型。经过几年的试验，证明 本方法可行。通过对鲤鱼的研究发现本方法可以获得很多表型发生变化的个体， 图1表示经随机扩增多态性RAPD检测获得不同基因型的个体，同时通过二次 扩增获得导致这些表型变化的序列；图2表示两条体型较小的个体的变异基因 扩增结果。 附图说明图1. RAPD引物S68扩增图。1 10是转基因鲤鱼的扩增图谱，11~19是普 通鲤鱼的扩增图谱，所有普通鲤鱼有的基因型，转基因鲤鱼都有，但个体4和 10没有扩增产物，是普通鲤鱼没有的基因型，说明导入序列在宿主基因组发生 作用，形成了新基因型。图2.用设计好的引物Gmprimer 1 + 1第二步扩增电泳图，control没有扩增 产物，1、 2是转基因小鱼的扩增产物，说明用导入的跟踪序列设计的引物可以 获得导入宿主的序列，测序后可获得特异分子标记。 具体实施例方式1、基因组DNA提取和DNA重排片断的构建取鲤鱼(肌肉或者血液)提取基因组DNA (—般是蛋白酶K法提取)。 提取的DNA先用一种限制性内切酶#M I酶切(反应体系150 nL反应总 体积中含l-10ng模板DNA、 2U酶、15 nL10xTango buffer; 37'C酶切16h本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鱼类转基因育种的方法，其特征是将某种鱼类本身的基因组ＤＮＡ经过预处理，成为一种有别于原基因组ＤＮＡ的ＤＮＡ重排片断，用转基因的方法将ＤＮＡ重排片断导入原种鱼类的卵细胞中，和原种鱼类的基因组发生作用，形成变异的基因，并产生外形突变的个体，从中筛选生产性状优良的个体，进行进一步选育；　通过设计好的扩增固定引物ｇｍｐｒｉｍｅｒ　２对这些突变个体基因组进行扩增，用目标区域扩增多态性ＴＲＡＰ方法判断ＤＮＡ重排片断是否进入突变个体的基因组，设计两个引物ｇｍｐｒｉｍｅｒ　１和ｇｍ ｐｒｉｍｅｒ　１＋１：用两步扩增法获得变异的基因，作为鉴定这些突变个体的分子标记；　所述某种鱼类本身的基因组ＤＮＡ预处理方法：提取某种鱼类的基因组ＤＮＡ，先用限制性内切酶Ｍｓｐ　Ｉ酶切反应，反应完成后用反应体系２倍体积的乙醇沉淀，１２ ０００转离心，吹干乙醇后，重新连接，连接反应结束后用２倍体积的乙醇沉淀，１２０００转离心，吹干乙醇后，再用限制性内切酶ＥｃｏＲ　Ｉ酶切，用２倍体积的乙醇沉淀，１２０００转离心，吹干乙醇后，加入跟踪接头序列ｇｍａｄａｐｔｏｒ　１连接，用２倍体积的乙醇沉淀，保存。

【技术特征摘要】
1、一种鱼类转基因育种的方法，其特征是将某种鱼类本身的基因组DNA经过预处理，成为一种有别于原基因组DNA的DNA重排片断，用转基因的方法将DNA重排片断导入原种鱼类的卵细胞中，和原种鱼类的基因组发生作用，形成变异的基因，并产生外形突变的个体，从中筛选生产性状优良的个体，进行进一步选育；通过设计好的扩增固定引物gmprimer 2对这些突变个体基因组进行扩增，用目标区域扩增多态性TRAP方法判断DNA重排片断是否进入突变个体的基因组，设计两个引物gmprimer 1和gmprimer 1+1用两步扩增法获得变异的基因，作为鉴定这些突变个体的分子标记；所述某种鱼类本身的基因组DNA预处理方法提取某种鱼类的基因组DNA，先用限制性内切酶Msp I酶切反应，反应完成后用反应体系2倍体积的乙醇沉淀，12000转离心，吹干乙醇后，重新连接，连接反应结束后用2倍体积的乙醇沉淀，12000转离心，吹干乙醇后，再用限制性内切酶EcoR I酶切，用2倍体积的乙醇沉淀，12000转离心，吹干乙醇后，加入跟踪接头序列gmadaptor 1连接，用2倍体...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹哲明，丁炜东，杨健，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]