本发明专利技术涉及Cre/loxP重组酶系统在菊花转基因育种中的应用。本发明专利技术利用基因枪介导的方法，将分别携带外源P5CS、NP-1基因以及Cre/loxP的植物表达载体共同转化地被菊，通过PCR及Southern杂交检测，确定获得了多基因整合转化的转基因株系；再通过4℃低温处理，使Cre表达，从而删除位于两个同向loxP位点间的选择标记基因，经过分子手段检测，证明所得结果正确，得到了不含有标记基因npt-II的地被菊转基因株系。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物育种领域，具体涉及利用Cre/loxP重组酶系统删除选择标记基因，获得无选择标记基因的转基因菊花的方法。
技术介绍
在植物的转基因研究中，标记基因普遍被用来从大量的转化细胞中筛选出阳性转化子，目前采用最多的为抗生素抗性基因或除草剂抗性基因。虽然，在观赏植物中使用标记基因不会对食品安全产生影响，但是，随着转基因技术的不断发展突破，转基因植物对生态环境污染等方面的问题越来越受到重视。目前，Cre/loxP系统是最完善也是应用最广泛的删除标记基因的方法，它可以定向删除转基因植物中的标记基因。Chakraborti等将Cre/ IoxP重组系统应用于烟草中，通过有性杂交获得了无标记基因的烟草。Koper等利用种子特异启动子诱导Cre酶的表达，在甘蓝型油菜中实现了标记基因的删除。利用诱导删除系统，在拟南芥、玉米、烟草、马铃薯、番茄、水稻等作物中都成功删除了标记基因。目前，诱导删除系统主要在双子叶植物中应用，在单子叶植物中的删除效率非常低。rd29A启动子可以在低温、干旱以及高盐胁迫下快速应答，常被应用于植物抗逆转基因研究中。李新玲等通过将拟南芥rd29A启动子转化烟草，表明其可在逆境胁迫诱导下驱动下游目的基因的超量表达，杨春霞等的试验也表明rd29A启动子在低温、干旱、高盐等环境胁迫下可以增强gus基因的表达。根据rd29A启动子的这一特点，将其构建到Cre/ IoxP系统的植物表达载体上，可以先利用抗性标记基因筛选出阳性转化子，然后在低温等诱导条件下诱导Cre重组酶基因表达，从而实现抗性标记基因的删除。地被菊植株低矮、株型紧凑、冠型丰满、花朵繁多、花色丰富，是极具绿化、美化及香化前景的优良园林地被植物。目前，地被菊主要在我国北京、天津及“三北”地区应用；在南方，由于气候湿热，还未得到广泛引种栽培。另外，随着全球气候条件的持续恶化，加强观赏植物的抗逆育种迫在眉睫，植物分子育种比传统的育种方法更具有预见性和创新性， 并能大大缩短育种周期。转基因植物的安全性以及遗传稳定性一直遭到质疑，利用Cre/ IoxP系统开展地被菊抗逆转基因育种方面的研究，为观赏植物的安全转基因育种提供技术参考。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术的目的在于提供Cre/loxP重组酶系统在菊花育种中的应用。本专利技术中，所述的应用是将目标基因和Cre/loxP分别构建到不同的植物表达载体中，共转化菊花，并诱导Cre基因表达后删除选择标记基因，获得无选择标记基因的转基因株系。在一个具体的实施方案中，将P5CS-F129A、NP-I和Cre/loxP构建到不同的植物表达载体中，共转化菊花，并诱导Cre基因表达后删除选择标记，获得无选择标记基因的转P5CS-F129A和NP-I基因的菊花转基因株系。其中，诱导Cre基因表达的启动子可为本领域公知的诱导型启动子，优选为 rc^9A，该启动子可在低温条件下诱导Cre重组酶表达，从而实现抗性标记基因的删除， 具体诱导方法为，将转基因阳性株系进行分化培养，并在分化培养过程中用4°C低温处理 12 24小时。本专利技术中，将选择标记基因构建于两个同向的IoxP位点之间。本专利技术中，可使用本领域公知的转化方法将携带不同基因的表达载体共转化菊花，优选的共转化方法为基因枪法或农杆菌介导法，最优选为基因枪法。本专利技术还提供一种无选择标记基因的菊花转基因方法，其为将目标基因和Cre/ IoxP分别构建到不同的植物表达载体中，共转化菊花，并诱导Cre基因表达后删除选择标记基因，获得无选择标记基因的转基因株系。本专利技术利用基因枪介导的方法，将分别携带外源P5CS、NP_1基因以及Cre/loxP的植物表达载体共同转化地被菊，通过PCR及Southern杂交检测，确定获得了多基因整合转化的转基因株系；在通过4°C低温处理，使Cre表达，从而删除位于两个同向IoxP位点间的选择标记基因，经过分子手段检测，证明所得结果正确，得到了不含有标记基因npt-II的地被菊转基因株系。附图说明图1所示为本专利技术涉及的植物表达载体示意图。其中A为HiSb-rd29A-Cre/lOX 构建图；B 为 PBin35s-NP-l ；C 为 pBPC_P5CS_FU9A。图2所示rd29A启动子PCR结果。图3为PCR鉴定Cre基因片段的结果。1，2为扩增得到的Cre片段。图4为酶切鉴定Cre基因片段结果。M为Marker DL2000 ；1，2为酶切鉴定阳性。图 5 为 PCR 鉴定 RD29A-Cre-Nos 结果。M 为 Marker DL2000 ；1-12 为 PCR 产物图6为酶切鉴定RD^A-Cre-nos结果。M为Marker DL2000 ；1-12为酶切结果，其中 1，2，5，7，8，9，10，11，12 鉴定阳性。图7所示为地被菊‘北林黄’抗性生根植物的获得。A，外植体分化；B，分化的外植体单体；C，分化芽在抗性培养基上的筛选；D，抗性芽继代筛选；E，抗性芽生根；F，完整抗性植株获得。图8所示为部分转基因株系PCR检测。M，DL 2000 (Takara) ； 1，阳性质粒；2，非转化植株；3 14，同一植株的扩增产物混合后琼脂糖凝胶电泳检测。 图9所示为转化株系Southern杂交检测。C，质粒阳性对照；1，未转化植株阴性对照；A，Bar基因探针针；B，Cre基因探针；C，NP-I基因探针；2 9为转化株系。图10所示为低温处理对外植体分化的影响。左图，低温使外植体分化的不定芽莲座化严重；右图，低温使外植体分化的不定芽玻璃化严重。图11所示为部分G1代转基因株系PCR检测。M, DL2000 (Takara) ； 1，阳性质粒；2， 非转化植株；3 16，同一植株的扩增产物混合后琼脂糖凝胶电泳检测。图12所示为G1代转基因株系的Southern检测。C为阳性质粒对照。具体实施例方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。实施例Pksb-rc^gA-Cre/lox植物表达载体构建先从拟南芥中PCR扩增出启动子rc^9A，用^CbaI和BamHI双酶切，与同样用)(bal 和BamHI双酶切的中间载体pUC18大片段相连得到中间载体pUC18_rd29A。WpCre质粒中 PCR扩增出目的基因Cre,并用NcoI和PstI双酶切，同时将pUC18_rd29A用NcoI和PstI 双酶切，连接得到中间载体pUC18-rd29A-Cre、再用PCR的方法从Pucl8-rd29A_Cre载体中扩增出rc^9A-Cre-nos读码框序列，并用&icl和MuI双酶切，与同样用&icl和MuI双酶切的表达载体Pksb连接得到消除选择标记系统的植物表达载体I^Sb-rd29A-Cre/lOX。(l)rd29A启动子的PCR扩增上游引物P1 (5 ‘ -GTCTCTAGACGACTCAAAACAAACAAACTTACG-3 ‘ )、rd29A 下游引物 P 2 (5 ‘ -CTTGGATCCMTCAMCCCTTTATTC-3 ‘ )。rd29A 的 PCR扩增体系为 25 μ L :40 IOOngDNA, 10ymol/L 弓| 物 PI、P2 各 1 μ L，IOXPCR 缓冲液 2. 5 μ L本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：张启翔，赵伶俐，张秀海，高亦珂，程堂仁，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：
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