本申请描述含Ｎｉｃ基因产物反应性元件的分离核酸，及其以下用途，用于生产降低水平烟碱和／或ＴＳＮＡ的转基因烟草植物、以及所含相关蛋白水平改变的其它植物或宿主细胞的方法，这是由于其中包括顺式作用诱饵元件。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请本申请要求2000年8月30日递交的临时申请序列号60/229,198的权益，其全部公开在此引作参考。烟碱主要在烟草植物根部形成，随后运送到叶子并在此储存(Tso，Physiology and Biochemistry of Tobacco Plants，pp.233-34，Dowden，Hutchinson & Ross，Stroudsburg，Pa.(1972))。烟碱由两种前体，烟酸和N-甲基吡咯啉缩合产生。它们来自两个不同的生物合成途径(见附图说明图1)(Bush and Saunders(1977)Proc.Am.Chem.Soc.Symp.，New Orleans，pp.389-425；Hashimoto and Yamada(1994)Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.45，257-285；Waller andDermer(1981)InThe Biochemistry of PlantsA ComprehensiveTreatise，P.K.Stumpf and E.E.Conn，eds.Academia Press，pp.317-395)。其中N-甲基吡咯啉阳离子由鸟氨酸或精氨酸通过腐胺合成(Leete(1980)InEncyclopedia of Plant Physiology，SecondaryPlant Products，Vol.8，E.A.Bell and B.V.Charlwood，eds，Springer-Verlag，pp.65-91；Tiburcio and Galston(1986)Phytochemistry，25，107-110)。相互移植试验表明，烟碱在根部合成并经过木质部运送到叶子和其它植物器官(Dawson(1941)Science，94，396397)。两个调节座位(Nic1和Nic2)调节烟碱生成。Legg等((1969)JHered，60，213-217)将来自低生物碱含量的古巴雪茄栽培种中的基因转入Burley 21栽培种。他们发现，低生物碱品系与标准栽培种在两个座位Nic1(以前称为A)和Nic2(以前称为B)上不同。这两个座位不连锁，基因作用为半显性且主要是累加性的(Legg等(1969)JHered.，60，213217)。Collins等((1974)Crop Sci.，14，77-80)制备了这四个生物碱基因型的加倍型单倍体烟草繁殖系。标准培养种的基因型是Nic1/Nic1 Nic2/Nic2，低烟碱品系的基因型是nic1/nic1nic2/nic2。Nic1/Nic1 nic2/nic2是高中间体型，nic1/nic1 Nic2/Nic2是低中间体型(Legg and Collins(1971)Can.J.Genet.Cytol.13，287-291)。这些品系在花期、叶数、叶大小和植株高度上相似。单和双Nic突变体根部酶分析显示，喹啉酸磷酸核糖转移酶(quinolinate phosphoriboxyl transferase)(QPTase)和腐胺甲基转移酶(putrescence methyl transferase(PMTase))(PMTase)，两种酶的活性与烟碱生物合成水平成正比(Saunders and Bush(1979)Plant Physiol 64236)。Nic1和Nic2都影响根部PMTase和QPTase活性并调节烟碱合成(Leete(1983)InAlkaloidsChemical andBiological Perspectives，S.W.Pelletier，ed.John Wiley & Sons，pp.85152)。Hibi等((1994)Plant Cell，6，723-735)分离了编码PMTase、PMT的cDNA，并显示PMT转录水平受Nic1和Nic2调节。已经分离出QPTase cDNA和基因组克隆(NtQPT1)，NtQPT1的转录水平也受Nic1和Nic2调节(Song，W.，Mendu，N.，and Conkling，M.A..(1999)Plant Cell，待发表)。因此这显示，Nic基因通过调节编码两个限速酶PMTase和QPTase基因的转录水平，从而调节烟碱含量。进一步显示，Nic1和Nic2是NtQPT1转录的正调节子，其转录起始位点上游的启动子序列包含NtQPT1转录Nic基因产物活化必需的顺式作用序列。因为QPTase和PMTase表达受Nic基因产物的共同调节，可能Nic基因产物也直接调节PMT基因转录。降低生物学产物如烟碱水平的途径之一，是降低导致该产物生物合成途径中所需酶(即QPTase和PMTase)的量。如果受影响的酶以限速量(相对于途径中所需的其它酶而言)天然存在，该酶丰度的任何降低将导致最终产物的生成减少。如果正常情况下酶量不在限速水平，为减少途径的产出必须将细胞中其含量降低到限速水平。反之，如果该酶的天然存在量在限速水平，该酶活性的任何增加将导致生物合成途径终产物的增加。通过反义调节腐胺甲基转移酶(PMTase)的表达改变烟草植物中烟碱水平在Nakatani和Malik的美国专利5,369,023和5,260,205中已经给出。Wahad和Malik的PCT申请WO94/28142描述了编码PMT的DNA以及正义和反义PMT构造物的用途。另外，Conkling等的PCT申请WO98/56923描述了编码植物喹啉酸磷酸核糖转移酶(QPRTase)的DNA、含这种DNA的构造物以及改变QPRTase表达以增加或降低植物烟碱生成的方法。尽管有以前的努力和成功，仍然需要降低植物中基因产物(例如，烟碱)生成的新方法。Nic基因反应性元件也可从美国专利5,459,252中公开的序列中获得，在此以其全部内容引作参考。在一些实施方案中，Nic基因产物反应性元件位于NtQPT1启动子-1000和-600或-700bp之间，其序列在美国专利5,459,252中公开。因此，一些实施方案涉及NtQPT1的300-400个核苷酸长的片段，正如美国专利5,459,252中公开，它们对应NtQPT1启动子-1000和-600或-700bp之间的序列。本专利技术另一方面是重组核酸构造物，其中含有/包含顺式作用调节元件如上述Nic基因产物反应元件，以及这种重组核酸在生产此处所述转基因植物或宿主细胞中的用途。构造物可以是载体，如轰击型核酸转移颗粒或农杆菌载体。包含这种构造物、并优选含其多拷贝的植物细胞也是本专利技术的内容。本专利技术进一步的方面是制造低烟碱含量和/或烟草特异性亚硝胺(TSNA)的转基因烟草植物的方法。该方法包括将含如上述Nic基因产物反应元件的外源核酸构造物导入所述至少一个烟草植物细胞，以产生至少一个转化烟草植物细胞。与缺少该外源核酸植物中的烟碱和/或TSNA水平相比，这至少一个转化烟草植物细胞包含外源核酸的量或拷贝数足以降低由该细胞或这些细胞再生的烟草植物中烟碱和/或TSNA水平。该方法可进一步包括由转化植物细胞产生烟草植物，以及(可选的)收集该烟草植物的烟叶、茎或种子。因而，由本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种选自下组的分离核酸：（ａ）基本上由根据ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１或其片段的序列组成的分离核酸，其中所述片段约２０－４５５个连续核苷酸；和（ｂ）与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１互补序列杂交、并对Ｎｉｃ基因产物应答的分离核酸。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：MA康克林，Y李，
申请(专利权)人：北卡罗莱纳州立大学，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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