非线性振幅介电电泳波形用于细胞融合制造技术

本发明专利技术涉及提供在生物细胞融合脉冲前处理生物细胞的方法，其包括用融合前电场波形处理生物细胞，其振幅随时间以非线性改变，从而采用相对低振幅，长持续时间融合前电场波形使生物细胞首先被排列，然后采用相对高振幅，短持续时间融合前电场波形压缩，使细胞融合前细胞膜接触提高。非线性融合前电场波形可以阶段式，连续的，Ｓ形的方式改变，按照非线性算法，采用阶梯式的提高相邻梯级的波形，采用阶梯式的提高非相邻梯级的波形。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物细胞之间融合的方法和装置。更具体地，本专利技术涉及提供用电场处理生物细胞的方法和装置，使生物细胞排列(align)并在进行细胞融合前提高细胞膜的接触。
技术介绍
如果一个天然带电的生物细胞放置于均匀电场中，如由一对平面的电极提供的电场，生物细胞并不向一个或另一个电极移动，因为来自于两个电极的吸引力是相同的。另一方面如果天然带电的生物细胞放置于非均匀电场，如由一对非平面的电极提供的电场，如图1现有技术，生物细胞形成偶极(dipole)，被相比另一个具有更大吸引力的电极所吸引，向具有更大吸引力的电极移动。这样的非均匀电场用于介电电泳(dielectrophoresis)，使用介电电泳排列活的细胞，然后融合/电穿孔脉冲以融合细胞已自七十年代早期见于文献中。此方法用于产生用于医疗目的的两种不同细胞类型的杂种，用于生产单克隆抗体的杂交瘤生产，用于核融合，用于生产其它杂种细胞。介电电泳是对天然带电的颗粒，如活细胞，施加电场力的方法。该电场力来自于非均匀电场，其在细胞内分别加电形成偶极。偶极形成后，非均匀电场使细胞向最低或最高电场强度移动。该移动取决于生物细胞或颗粒，介质的相对电导率和介电常数。该双向电场力是电场平方的函数，所以电场极性并不重要。该力是生物细胞或颗粒，介质的相对电导率和介电常数的函数。典型地，AC电压波，如正弦波，施加于电极间以产生交替电场。正弦波电压，频率，持续时间(duration)根据特定细胞类型优化。施加AC以排列细胞后，施加一或多个融合/电穿孔脉冲以在细胞膜上形成通道，在此来自两个细胞的细胞膜混合。这样的通道使多个细胞的成分混合以形成杂种细胞。融合脉冲后，可施加另一AC电场以保持细胞在一起从而使融合细胞稳定。在某些情况下，AC电压线性增加或减少以阻止由于电场的突然施加而对细胞的损害。细胞融合的应用实例包括杂交瘤生产和细胞核传递。电融合的最近应用是生产用于癌症免疫治疗的治疗杂种。这些杂种产生自体外(ex-vivo)方法的癌症肿瘤细胞和免疫系统树突状细胞。每一治疗需要大量活杂种，这提出了对高效生产杂种的方法的要求。有很多技术可用于进行细胞融合(电的，机械的，化学的)。本专利技术涉及电的方法。现今的电技术使用与电极装置相连的电压波形发生器。根据相关的已知电的，机械的，化学的技术，下列文献引用作为参考4,326,934 April 27，1982 Pohl4,441,972 April 10，1982 Pohl4,764,473 Augustl′6，1988 Matschke等4,784,954 November 15，1988 Zimmermann5,304,486 April 19，1994 Chang6,010,613 January 4，2000 Walters等WO00/60065 October 12，2000 Walters等根据上述，已知使用具有固定振幅(amplitude)，参见图3现有技术，或线性增加振幅，参见图4现有技术，的融合前电场波形(pre-fusionelectric field waveform)。图5表示了现有技术进行电场波的细胞融合整体方案，其中融合前电场波形后是融合/电穿孔脉冲，然后是融合后电场波(post-fusion electric field waveform)。然而，融合前电场波形固定振幅或线性增加振幅后的细胞融合的效率不能达到应用于癌症免疫治疗的治疗杂种生产所需的较高效率。因此，需要提供融合前电场波形，其可相对用固定振幅或线性增加振幅融合前电场波形，提高生物细胞的细胞融合效率。更具体地，根据Chang的U.S.5,304,486，其中图2E公开了线性低电压presine AC波形，高电压线性电穿孔AC波形，和低电压线性后穿孔AC波形。Chang的专利技术仅局限在融合/电穿孔脉冲。Chang只公开了线性低电压presine AC波形。Chang没有公开非线性低电压presine AC波形。Chang没有关注presine AC波形，而只是泛泛提及。细胞融合系统的第一步是将细胞接触。在任何情况下，必须对细胞施加足够的力以克服负表面电荷。只施加均匀电场将不会移动细胞，因为细胞的静电荷是零。因此，从电场的定义没有施加力力＝(电场)*(电荷)然而，非均匀电场在细胞内移动正离子到一侧，负离子到另一侧而产生偶极，如图1现有技术所示。一旦诱导产生了偶极，因为在一侧的电场强度大于另一侧，对细胞就会产生净余的力。细胞在一个方向的移动引起细胞在某一区域集中。由于细胞现在是偶极，细胞的负电侧会吸引另一细胞的正电侧以克服负表面电荷，如图2现有技术所示。由电极装置产生非均匀电场。非均匀性是电极参数的函数，如图1和2现有技术所示。通常，要融合的细胞类型放置于低电导介质(低于0.01S/m)以最小化电阻加热(ohmic heating)，其可能损害细胞并引起扰动(turbulence)而减少融合杂种数。因此，需要要进行细胞融合的生物细胞被处理以降低细胞排列和细胞膜接触过程中的热量。波形发生器具有两个功能。第一个是产生AC电压波，其通过电极装置转化为AC电场。此AC电场然后使细胞排列/接触。第二个功能是产生脉冲电压，其电穿孔细胞膜，融合细胞。在某些情况下，AC电压在融合脉冲后产生以保持细胞成列，直到融合产物成活或稳定。成功融合的因素之一是相邻细胞间的膜接触。融合脉冲施加前的此接触越接近，融合效率越高。在U.Zimmermann等，″Electric Field-InducedCell to-Cell Fusion”，J.Membrane Biol.67，165-182(1982)中，Zimmermann指出提高融合脉冲前AC波电场强度可能是优选方法。明显地，需要待融合生物细胞用融合前电场波形预处理，其产生增加的细胞膜接触而没有扰动或加热。此外，为什么不希望马上提供高振幅排列波形给待融合细胞有几方面的原因。第一个原因是机械原因。马上施加高振幅排列波形会引起极端力在细胞上，引起细胞向电极快速移动。该快速移动会在细胞周围介质引起扰动力。此扰动力使不会形成细胞的完整串珠链(pearl chains)，扰动力会引起已经形成的细胞串珠链破裂。第二个原因是这样的高振幅排列波形会引起细胞悬浮于其中的介质加热。加热也会引起扰动，从而使排列细胞的完整的串珠链不能形成，并引起已经形成的细胞串珠链破裂。介质中的热量也会降低细胞存活力。如上所述，希望避免由于马上施加高振幅排列波形给待融合生物细胞而引起的机械力，扰动，加热。因此，现有技术中指出在采用电穿孔脉冲进行细胞融合前，使用融合前电场波形是已知的，上述技术没有教导或提示用于细胞融合的介电电泳波形，其具有下列特征组合(1)提供融合前电场波形给生物细胞，其提高用固定振幅或线性增长振幅融合前电场波形的生物细胞的细胞融合效率；(2)避免了由于马上施加高振幅排列波形给待融合生物细胞而引起的机械力，扰动，加热；(3)降低了用于在细胞融合前提高细胞排列和细胞膜接触的用融合前电场波形处理的生物细胞的加热；(4)在进行细胞融合前，提高了用融合前电场波形处理的生物细胞间的细胞膜接触。上述希望的特征由用于本专利技术细胞融合的独特的非线性介电电泳波形提供，下本文档来自技高网...

【技术保护点】
在对生物细胞进行一或多个细胞融合／电穿孔脉冲前处理生物细胞的方法，包括如下步骤：采用融合前电场波形处理细胞，所述波形振幅根据时间以非线性方式改变。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：理查德E沃尔特斯，德林C沃尔特斯，艾伦D金，
申请(专利权)人：塞托帕尔斯科技公司，
类型：发明
国别省市：US[]