本发明专利技术的目的在于提供一种用外原性物质处理泡囊以将外原性物质嵌入泡囊中的电穿孔法，该方法包括下列步骤：ａ）将泡囊和外原性物质的悬浮液保留在包括电极的室中的处理容积内，其中该室具有由电极间距的平方（ｃｍ↑［２］）除以室体积（ｃｍ↑［３］）的商定义的几何因子（ｃｍ↑［－１］），其中该几何因子小于或等于０．１ｃｍ↑［－１］，其中所述泡囊和外原性物质的悬浮液处于介质中，该介质经调整以便其电导率为０．０１～１．０毫西门子，其中在处理过程该悬浮液封闭在室中，及ｂ）用一个或多个脉冲电场处理封闭在室中的悬浮液。利用该方法，所述悬浮液的处理容积是可以按比例变化的，而且泡囊在室中的处理时间基本上是均匀的。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
总体上本专利技术涉及一种离体(ex vivo)电穿孔法，更具体地，本专利技术涉及一种特别适于临床和工业应用的电穿孔法。
技术介绍
多年以来，在文献中已经论述了为了治疗目的，利用离体或体外(in vitro)电穿孔法将大分子导入活细胞中。电穿孔的目的在于增强分子进出活细胞或非活体泡囊(vesicle)的移动。电穿孔的实际用途很多，并且可以根据所导入物质的复杂性、导入场所和导入目的而变化。复杂性包括从难于进入细胞的小的药物分子到多核苷酸的复杂混合物。广义上讲，导入场所分为体内(in vivo)导入和离体导入。体内部位的选择基于要处理的组织的位置和是否需要局部或全身处理。该方法可应用于临床和工业。在临床和工业应用中，常常希望将大分子嵌入到许多细胞中并确保所有细胞均被同等地处理了。为此，需要同时处理所有的细胞，以保证所有细胞均经受相同的处理条件。导入的治疗用途很多。其一些实例包括基因置换疗法，用于后天性疾病的治疗性遗传性药物，多核苷酸疫苗，免疫疗法，增强的化学疗法及其它。工业和农业应用同样是多样的。工业应用的一些实例包括从发酵罐中产生的细胞中提取物质，用于制备重组体蛋白的大规模转染，工业用途的细胞改良，液体或疫苗生产的杀菌。农业用途的一些实例包括牲畜(包括有蹄类、鸟类和水生动物)的疫苗和用于改善选定性状的基因改性。对于标准的体外电穿孔而言，通常使用比色杯(cuvette)。这些比色杯是由平行板电极构成的嵌入塑料中的且容量有限的腔室。用于这些比色杯的容积小于1毫升。有限的容积限制了处理细胞的总容量。常用的细胞密度为每毫升100万～1000万个细胞。细胞一般放在具有高离子含量的生理介质如磷酸盐缓冲的盐水中，其电导率为每立方厘米0.017西门子/cm(17000mS/cm)。在电穿孔中，细胞密度是重要的参数。如果细胞不足够稠密，那么就浪费了治疗性物质或其它物质。如果细胞太稠密，则每个细胞附近的电场在方向或强度方面就不均匀。为了得到临床应用所需的一致性结果，接近细胞的电场必须在方向和强度方面都是均匀的。根据Fomekong等人在“Passiveelectrical properties of RBC suspensionschanges due to distribution ofrelaxation times in dependence on the cell volume fraction and mediumconductivity”，in Bioelectrochemistry and Bioenergenetics，1998，Vol 4781-88)中所述，细胞对于细胞悬浮液的电性质的影响，取决于细胞的红细胞压积(packed cell volume)。对于小于10％的红细胞压积，细胞之间的距离快速增加，因此，在低于10％的红细胞压积下，电场中一个细胞对于另一个细胞的干扰作用快速下降。直径为15微米的典型细胞在约6000万个细胞/ml的密度下会具有10％的红细胞压积(利用0.000001767mm3/细胞的平均细胞体积算得)。因而，应该使用6000万个细胞/ml以下的细胞密度，通常使用3000万个细胞/ml以下的细胞密度。表1电极室容积的毫升数 临床应用通常需要1000万～5亿个其中已经适当地嵌入了大分子的细胞。如果处置需要5个剂量，且每个剂量(处置)需要1000万个细胞，那么必须准备至少5000万个治疗细胞。如果假定电穿孔法的效率为50％，且细胞以2000万个细胞/ml的浓度接受处理，那么将需要5ml容量的电极(5000万×2/2000万)。如果需要1亿个治疗细胞，则需要10ml容量的电极。要获得所需的容量，不能简单地增加电极的尺寸，因为由于电极电阻的降低，电极尺寸的增加导致电流强度成比例地增加。随着电极尺寸增加，只要所用介质的电导率保持恒定，电极电阻就降低。如果需要1亿个治疗细胞且输入细胞密度为每毫升2000万个细胞，那么就需要20ml电极。这种情况下，仅按比例将电极的尺寸增加到20毫升并不起作用。电极体积的增加，电极的电阻因介质的电导率而降低。介质在电极中的电阻计算如下式1 式中σ为电导率，单位为西门子/cm，间距单位为cm，极板面积单位为cm2。另外式2体积＝间距×面积(cm3)，及式3 在上面提及的式1、2和3出自Electroporation and Electrofusion in CellBiologv，edited by Eberhard Neumann，Arthur Sowers，and Carol Jordan，PlenumPress，1989。下面表2给出了在4-毫米间距和介质电导率为0.017西门子/cm的条件下，作为体积的函数的电极室电阻。表2 当电极室体积超过1ml时，离子溶液的电阻小得不切实际；由于破坏细胞的高脉冲电流，将会产生显著的溶液加热作用。为了解决该问题，已经开发出流动经过(flow through)技术。在该方法中，大体积的介质流过小的处理室，并将电压脉冲波形施加到室中的平行板电极上。该方法的问题在于1.不是所有细胞都暴露于强度和方向相同的电场。2.不能保证要嵌入的物质的密度和细胞的密度均为恒定的。3.仅可以施加均匀的脉冲电压。不能使用如US 6010613中所公开的可变矩形脉冲波形。在流动经过法中，没有保证所有的细胞均经受强度和方向相同的电场。在这方面，因为层流和湍流的性质，在流动经过法中不是所有的细胞都被处理相同的时间。最接近流经性导管壁的薄层比远离管壁的薄层移动得慢。流动经过法既可以用于电场强度超过20000伏特/cm的食品加工中，也可以用于为了治疗目的而将分子嵌入细胞中。在电穿孔领域存在大量的现有技术，而且这些大量现有技术的许多方面都是本专利技术特别感兴趣的。例如，本专利技术特别感兴趣的是电穿孔介质的公开，特别关注的是介质参数。在这方面，本文中的表3列出了很多与电穿孔介质参数如阳离子、阴离子、摩尔渗透压浓度和缓冲液有关的文献。表3下表总结了本领域的现状 关于表3的具体内容，US 5124259描述了一种提供高转染效率的电穿孔介质。该介质含有钾离子(35～105毫克当量/升)和有机阴离子且基本上不含氯离子。由于钾离子，该介质是高度导电的。没有讨论为了能够利用大电穿孔电极而利用低导电介质。US 6040184和US 6338965描述了一种基本上不含离子的电穿孔介质。通过利用糖和非无机离子，使该介质为非离子性。该专利描述了利用非离子性介质而在细菌中增加的转染效率。该专利没有提及为了提供若干电导率及因此提供若干电流以在电穿孔过程中保持电场，而加入少量有机离子。US 6368784描述了一种电穿孔缓冲液，其也是低温防护剂。该专利还描述了将该物质用于在转染之前冷冻细胞。所使用的介质具有高浓度的钾离子，其与细胞内的细胞质中相似并与在US 5124259中所述相似。该专利没有描述为了能够利用更大容量电极，而利用具有较低电导率的电穿孔介质。介质的电导率影响物质向细胞的移动。Djuezenova(Djuzenova等人，Biochemica et Biophysica Acta V 1284，1996，p14本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用外原性物质处理泡囊以将该外原性物质嵌入泡囊中的方法，该方法包括下列步骤：ａ）将泡囊和外原性物质的悬浮液保留在包括电极的室中的处理容积内，其中该室具有通过电极间距平方（ｃｍ↑［２］）除以室体积（ｃｍ↑［３］）而得到的商来定义的几何因子（ｃｍ↑［－１］），其中所述几何因子小于或者等于０．１（ｃｍ↑［－１］），其中所述泡囊和外原性物质的悬浮液处于介质中，该介质经过调整，使其电导率为０．０１～１．０毫西门子，其中所述悬浮液在处理过程被封闭在所述室中；及ｂ）用一个或多个脉冲电场处理封闭在所述室中的悬浮液，其中根据上述的ａ）和ｂ）步骤，所述悬浮液的处理容积是可以按比例变化的，而且其中所述泡囊在室中的处理时间基本上是均匀的。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：理查德E沃尔特斯，阿兰D金，
申请(专利权)人：塞托帕尔斯科技公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。