一种优化的电穿孔技术转染悬浮细胞的方法技术

本发明专利技术属于哺乳动物细胞基因工程领域，具体是一种优化的电穿孔技术转染悬浮细胞的方法，特别是适用于难转染的CEMx174细胞系。其特征是用含10％血清的RPMI-1640细胞培养基为电穿孔缓冲液，以合适的浓度混合细胞与外源DNA，然后使用电穿孔仪进行电转染，将外源DNA导入细胞内。本方法不需要特殊制备的电转缓冲液以及其他转染试剂，可方便快速的将外源DNA导入细胞，同时获得较高的悬浮细胞转染效率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于哺乳动物细胞基因工程领域，具体是，特别是适用于难转染的CEMX174细胞系。
技术介绍
转染是将外源核酸导入真核细胞中并发挥其生物学作用的一种技术，导入的核酸包括DNA (质粒和线性双链DNA)，反义寡核苷酸及RNAi (RNA interference) 0目前，基因转染技术已广泛应用于基因组功能研究(基因表达调控，基因功能，信号转导和药物筛选研究)和基因治疗研究。转染技术根据时效可分为瞬时转染和稳定转染两大类。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，可导入多个拷贝，获得目的基因暂时的高水平表达，适用于在转染后I~4天内收获细胞，检测目的基因表达结果的实验。稳定转染是用于建立单克隆的细胞系，使得目的基因整合到靶细胞染色体中或者以游离形态稳定存在于持续传代培养的细胞中，指导目的基因的适量表达。一般来说，稳定转染的表达效率比瞬时转染低I~2个数量级，但是效果更持续稳定，重复性好。通常利用可选择的遗传标记物用药物筛选出转染成功的细胞，建立单克隆细胞系，如G418 (新霉素抗性)，氨喋呤(胸苷激酶抗性)，嘌呤霉素(嘌呤霉素-N-乙酰基转移酶抗性)。现今常用的转染方法可归为三类:生化方法，病毒介导的方法以及物理方法。生化方法是实验室中最为常用的一种，是通过转染试剂与核酸形成复合物后易化核酸接近贴壁的细胞并促进细胞的内吞作用使核酸进入细胞内，常用DEAE-葡聚糖法，磷酸钙法，脂质体法等。但是由于细胞膜结构的差异，或是悬浮团簇状生长的方式降低了复合物与细胞接触的几率，这类转染方法对于悬浮细胞效果甚不理想。虽然有很多号称可以转染悬浮细胞的新型改良试剂，但其结果依然差强人意。病毒介导的转染通常是用逆转录病毒载体。它属于RNA病毒，可在靶细胞内反转录产生DNA互补链，此DNA单链可作为模板合成第二条DNA链，第二条DNA链可掺入细胞基因组DNA中。此病毒可利用宿主细胞的酶自行转录与复制，RNA可合成蛋白，再包装病毒，从胞内释放，成为感染性病毒，其介导的过程可使病毒单拷贝基因组稳定地进入细胞。理论上，这种逆转录病毒载体介导的转染方法可以获得较高的转染效率，但是其前期的准备工作繁琐复杂，且存在一定的安全风险，不适合广泛的应用。而且，根据本室的实践研究，该方法转染悬浮细胞的结果也并不理想。而常用的物理方法有两种:通过直接显微注射将细胞膜穿孔并导入核酸，或利用短暂的电流脉冲在质膜上瞬时形成可让核酸通过的微孔并使核酸在电场作用下主动进入细胞。前者主要用于转基因动物的制备，不适于大量细胞的转染。而电穿孔技术的应用范围则更广泛，可以快速、简便、有效的将DNA导入包括细菌、酵母、植物细胞与多种培养的哺乳动物细胞中。CEMx174细胞系是人T、B淋巴母细胞杂交株，由721.174(LCL721B淋巴母细胞系变种)和CEMR.3 (CEM T淋巴母细胞系的氮鸟嘌呤和乌巴音抵抗克隆株)杂交得来(SalterRD, Howell DN, 1985) ? 该细胞株表达 CXCR4 (Strizki JM et al，1997)，CCR5 (Miyagi T etal，2000)，孤儿受体GPR15(Kiene M et al，2012)等，是重要的SIV及HIV感染的细胞模型，广泛用于病毒感染的机制以及临床药物作用的研究(Dong MX et al,2012 ；Lim HG et al,2008 ；Newman JT et al，2007)。同时，CEMxl74细胞系也表达阿片受体(μ / κ / Λ )，因此经常用于吗啡等阿片类药物的作用机理研究及临床应用研究(Miyagi T et al,2000 JinXu et al,2004 ；Han Liu et al，2009)。然而，CEMxl74细胞系与其他的淋巴细胞系(如Jurkat, U937等)具有相同的生长特性，呈悬浮团簇状生长在培养液中，同样，转染效率非常低，经常严重的阻碍实验研究的进行。常用的脂质体转染试剂或阳离子转染试剂都不能达到让人满意的效果，转染效率低而且重复性差，直接干扰了后续实验的进行，对实验结果的可信度和可靠性造成干扰。 对于这类常规转染方法无计可施的悬浮细胞细胞系来说，电穿孔法是一种简便高效的方法。但是电穿孔的条件对于结果影响非常大，电流脉冲的强度和时间，以及电转缓冲液的选择都会严重的影响细胞的转染效率及生存率。但由于细胞膜结构的差异，不同细胞系的电穿孔条件有时会有很大的差异，而电穿孔仪器优良的性能往往会提供十分宽泛的电击强度及时间范围，因此最优条件的筛选是电转染的一大难题。当然一些制造生物仪器的公司已针对最常见的细胞系拟定了具体的电穿孔条件，或者在机器内部预设了相关的程序，可获得较高的转染效率，但其配套的耗材或者缓冲液往往昂贵，预设的条件更是将范围固定在特定仪器，不利于广泛应用。本专利技术即是为了改变这种现状，经过筛选得到了一组优化的悬浮细胞转染条件范围，而使其能广泛用于多种电穿孔设备，而且所需耗材皆为实验室中常规耗材，电转缓冲液则使用离子浓度较低的RPM1-1640培养液，同时，在参考文献资料后加入10%的血清，起到保护细胞的作用，提高电刺激后细胞的存活率。进而又针对CEMxl74系进行了更细致的优化，将电穿孔条件固定为4mm电极杯，以预热的RPM1-1640培养液(含10%血清)为电转缓冲液，脉冲强度210v，脉冲时间30ms，电击一次。经过多次验证，该条件可获得至少> 50%的转染效率。
技术实现思路
本专利技术开发了一种用普通商用电穿孔仪快速高效转染悬浮细胞的方法，特别是淋巴细胞系CEMxl74细胞系。CEMx174细胞系是人T、B淋巴母细胞杂交株，由721.174(LCL721B淋巴母细胞系变种)和CEMR.3 (CEM T淋巴母细胞系的氮鸟嘌呤和乌巴音抵抗克隆株)杂交得来。细胞在含有10%血清的RPM1-1640培养基中培养，以团簇形态悬浮生长。本专利技术是以预热37°C的RPM1-1640细胞培养基(含10%血清)为电穿孔缓冲液，以合适的浓度分别重悬细胞与外源DNA，混合后转移到4_的电极杯中，使用普通商业化电穿孔仪为BTX公司ECM830细胞电融合仪，电击条件为LV模式下以210mV脉冲电击一次，持续时间30ms，主要包括以下步骤:1.细胞培养。细胞培养于RPM1-1640完全培养液中(含10%血清)，在状态良好处于对数生长期时收集用作实验。2.培养液预热。根据实验的需求取适量培养液加入孔板或平皿中，在电转染实验操作开始之前放入37°C的C02培养箱中预热。3.收集计数细胞。将细胞收集在一起，轻柔混匀，取出少量细胞计数，根据计数结果量取适量的细胞悬液，800rpm(90g)离心10min，尽量吸净上清，以一定量预热的完全培养基重悬细胞，使细胞与DNA稀释液混合后的终浓度达到I X 107。4.稀释DNA。收集细胞的同时，取适量转染级DNA同样用适量的预热培养基稀释，体积不超过总体积的1/6。所需质粒的质量与质粒大小成正比，即每100 μ I体系需要Ikb的质粒量为I μ go5.电转染。轻柔混匀细胞悬液和DNA稀释液，转移到4mm的BTX电极杯中，合上杯盖，放入电极槽。电转条件:4mm电极杯，电压210v，脉冲长度30本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种转染悬浮细胞的方法，其特征在于以预热的含10％血清的RPMI‑1640细胞培养基为电穿孔缓冲液，混合细胞与外源DNA混合，然后用电转化系统进行电转染，将外源DNA导入细胞内。

【技术特征摘要】
1.一种转染悬浮细胞的方法，其特征在于以预热的含10%血清的RPM1-1640细胞培养基为电穿孔缓冲液，混合细胞与外源DNA混合，然后用电转化系统进行电转染，将外源DNA导入细胞内。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的电转染缓冲液不含抗生素。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的预热环境为37°C恒温细胞培养箱。4.一种转染人CEMX 174细胞系的方法，CEMX 174细胞系为人T、B淋巴母细胞杂交系，其特征在于，以预热的含10%血清的RPM1-1640细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯雯婷，蒋卫，李慧，张超，李刚，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京;11