用于转染细胞的方法和产品技术

本发明专利技术部分涉及编码蛋白质的核酸；含有非规范核苷酸的核酸；包含核酸的治疗剂；用于诱导细胞表达蛋白质的方法、试剂盒和装置；用于转染、基因编辑和重新编程细胞的方法、试剂盒和装置；以及使用这些方法、试剂盒和装置产生的细胞、生物体和治疗剂。本文公开了使用RNA用于诱导细胞表达蛋白质和用于重新编程和基因编辑细胞的方法。还公开了用于从患者样品中产生细胞的方法、使用这些方法产生的细胞以及包含使用这些方法产生的细胞的治疗剂。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于转染细胞的方法和产品优先权本申请要求2011年12月5日提交的美国临时申请号61/566，948、2011年12月12日提交的美国临时申请号61/569，595、2012年4月24日提交的美国临时申请号61/637，570、2012年5月7日提交的美国申请号13/465,490以及2012年6月26日提交的美国临时申请号61/664，494的优先权，所述申请都特此以引用的方式整体并入。专利
本专利技术部分涉及编码蛋白质的核酸；含有非规范核苷酸的核酸；包含核酸的治疗剂；用于诱导细胞表达蛋白质的方法、试剂盒和装置；用于转染、基因编辑和重新编程细胞的方法、试剂盒和装置；以及使用这些方法、试剂盒和装置产生的细胞、生物体和治疗剂。电子呈送的文本文件的描述由此电子呈送的文本文件的内容以引用的方式整体并入本文:序列表的计算机可读格式副本(文件名:FABI_001_0lffO_SeqList_ST25.txt ;记录日期:2012年12月4日；文件大小:18KB)。背景核酸转染 可以通过在体外和体内使核酸与带电的脂质、利匹哆异德(Iipidoid)、肽、其聚合物或混合物预先复合来将核酸递送至细胞。此类转染试剂为可商购的，并且广泛用于将核酸递送至培养的细胞。暴露于转染试剂-核酸复合物的细胞可以通过内吞作用或其它方式内化这些复合物。一旦在细胞里面，核酸可以进行它的预期的生物功能。在蛋白质编码RNA的情况下，例如，RNA可以通过细胞的核糖体翻译成蛋白质。无血清细胞培养动物血清如胎牛血清(FBS)通常用作细胞培养基中的补充剂以促进许多类型的细胞的生长。然而，血清的不确定性质使得与这种组分接触的细胞对于研究和治疗应用而言不可取。因此，已开发了无血清细胞培养基以消除批料与批料之间的变化和被与血清缔合的毒性物质和/或病原物质污染的危险。血清中最丰富的蛋白质为血清白蛋白。血清白蛋白在体外和体内结合各种各样的分子，包括激素、脂肪酸、钙离子和金属离子以及小分子药物，并且可以在体外和体内将这些分子运输至细胞。血清白蛋白(最经常地牛血清白蛋白(BSA)或人血清白蛋白(HSA))是无血清细胞培养基中的常见成分，其中它通常在lg/L至10g/L的浓度下使用。血清白蛋白传统上通过乙醇分级分离(“科恩(Cohn)”工艺)由血浆制备。分离含有血清白蛋白的级分(“科恩级分V”或简单地“级分V”)，并且通常不需进一步处理而使用。因此，血清白蛋白的标准制剂包含蛋白质部分(血清白蛋白多肽)和缔合分子部分(包括结合血清白蛋白多肽的盐、脂肪酸等等)。血清白蛋白的缔合分子组分的组成通常是复杂和未知的。可以处理血清白蛋白用于某些专门的应用(参见Barker A method for thede1nizat1n of bovine serum albumin.Tissue Culture Associat1n.1975 ；Droge 等B1chem Pharmacol.1982 ；31:3775-9 ;Ng等Nat Protoc.2008 ；3:768-76 ;美国专利申请公布号US2010/0168000，所述参考文献和专利申请的内容特此以引用的方式并入)。这些处理方法最常见用来使球蛋白和污染病毒从血清白蛋白的溶液中去除，并且经常包括通过添加短链脂肪酸、辛酸，接着是热灭活/沉淀污染物来稳定血清白蛋白多肽。针对高度专门化的干细胞培养应用，使用离子交换树脂使过量盐从BSA溶液中去除已示出增加细胞存活力(参见Ng等Nat Protoc.2008 ；3:768-76 ;美国专利申请公布号US2010/0168000，所述参考文献和专利申请的内容特此以引用的方式并入)。然而，重组血清白蛋白没有获益于所述处理，甚至在相同敏感的干细胞培养应用中(参见Ng等Nat Protoc.2008 ;3:768-76 ;美国专利申请公布号US 2010/0168000，所述参考文献和专利申请的内容特此以引用的方式并入)，证明了这些应用中的去离子化的作用是为了使过量盐从白蛋白溶液中去除，并不改变白蛋白的缔合分子组分。另外，先前尚未探索所述处理对其它细胞类型如人成纤维细胞的作用和所述处理对转染效率和转染相关的毒性的作用。此外，白蛋白缔合的脂质已示出是对人多能干细胞培养关键的，并且从白蛋白中去除这些已示出会导致人多能干细胞的自发分化，甚至当将脂质分开地添加至细胞培养基中(参见Garcia-Gonzalo等PLoS One.2008 ；3: el384，所述参考文献的内容特此以引用的方式并入)。因此，认为含有带未修饰的缔合分子组分的白蛋白的细胞培养基是对人多能干细胞培养关键的。重要地，先前尚未探索脂质载体如白蛋白的缔合分子组分与转染效率和转染相关的毒性之间的关系。细胞重新编程可以通过将它们暴露于具体细胞外信号(cue)和/或通过异位表达具体蛋白质、微RNA等等来重新编程细胞。虽然先前已描述了若干重新编程方法，但是依靠异位表达的大多数方法要求引入外源DNA，这会携带突变危险。已报道了基于直接递送重新编程蛋白的无DNA重新编程方法，然而这些方法效率太低并且对于商业使用而言不可靠。另外，已描述了基于RNA的重新编程方法，然而，当在成年细胞上进行时，现有的基于RNA的重新编程方法是缓慢的、不可靠的和效率低的，要求许多转染(导致相当大的费用和出错机会)，可以仅重新编程有限数量的细胞类型，可以使细胞重新编程为仅有限数量的细胞类型，要求使用免疫抑制剂并且要求使用多种人来源的组分，所述人来源的组分包括血液来源的HSA和人成纤维细胞供给者(feeder)。先前公开的细胞重新编程方法的许多缺点使得它们对于研究和治疗使用而言不可取。基因编辑若干天然存在的蛋白质含有DNA结合结构域，所述DNA结合结构域可以识别具体DNA序列，例如锌指(ZF)和转录激活因子样效应子(TALE)。含有一个或多个DNA结合结构域和核酸酶的催化结构域的融合蛋白可以用来在细胞中的DNA的希望的区中产生双链断裂。当与含有同源于细胞的DNA的一个或多个区的DNA模板组合时，基因编辑蛋白可以用来插入DNA序列或另外地以控制的方式改变细胞的DNA的序列。然而，用于基因编辑细胞的大多数目前的方法使用基于DNA的载体来表达基因编辑蛋白。因此，这些基因编辑方法是效率低的，并且携带不受控制的诱变的危险，使得它们对于研究和治疗使用而言不可取。先前尚未探索用于无DNA基因编辑体细胞的方法，或用于同时或依次基因编辑和重新编程体细胞的方法。最后，先前尚未探索在抗细菌、抗病毒或抗癌治疗中使用基因编辑。模式生物已通过胚胎微注射编码锌指核酸酶和TALE-核酸酶(TALEN)的核酸来产生基因敲除大鼠。还已经通过将编辑锌指核酸酶的核酸注射到胚胎中而在小鼠和大鼠中报道了引入序列特异性突变(又称为“敲入”)的基因编辑。使用胚胎干细胞产生基因修饰的大鼠，并且通过体细胞重新编程产生有种系形成能力的大鼠多能干细胞。然而，先前尚未探索使用基因编辑的重新编程细胞来产生基因修饰的生物体，包括小鼠和大鼠。本领域中存在对用于转染细胞的改进方法和产品的需要。专利技术概述因此，本专利技术提供了用于诱导细胞表达蛋白质和用于转染、重新编程和基因编辑细胞的试剂、方案、试剂盒以及装置。不像先前报道的方法本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种合成RNA分子，其包含三个或更多个非规范核苷酸，所述每个非规范核苷酸包括来自以下的一个或多个取代：嘧啶位置2C、嘧啶位置4C、嘧啶位置5C、嘌呤位置6C、嘌呤位置7N以及嘌呤位置8C。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.12.05 US 61/566,948;2011.12.12 US 61/569,595;1.一种合成RNA分子，其包含三个或更多个非规范核苷酸，所述每个非规范核苷酸包括来自以下的一个或多个取代:嘧啶位置2C、嘧啶位置4C、嘧啶位置5C、嘌呤位置6C、嘌呤位置7N以及嘌呤位置8C。2.如权利要求1所述的合成RNA分子，其中所述合成RNA分子由体外转录产生。3.如权利要求1所述的合成RNA分子，其中所述合成RNA分子进一步包含以下的至少一种:5’ -帽、5’ -帽I结构和3’ -聚(A)尾。4.如权利要求1所述的合成 RNA分子，其中至少两个所述非规范核苷酸为嘧啶。5.如权利要求1所述的合成RNA分子，其中所述非规范核苷酸包括以下的至少一种:假尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、5-氮杂尿苷、5-羟基尿苷、5-氨基尿苷、5-甲基尿苷、2-硫代假尿苷、4-硫代假尿苷、5-羟基假尿苷、5-甲基假尿苷、5-氨基假尿苷、假异胞苷、5-甲基胞苷、N4-甲基胞苷、2-硫代胞苷、5-氮杂胞苷、5-羟基胞苷、5-氨基胞苷、N4-甲基假异胞苷、2-硫代假异胞苷、5-羟基假异胞苷、5-氨基假异胞苷、5-甲基假异胞苷、N6-甲基腺苷、7-脱氮杂腺苷、6-硫代鸟苷、7-脱氮杂鸟苷、8-氮杂鸟苷、6-硫代-7-脱氮杂鸟苷、6-硫代-8-氮杂鸟苷、7-脱氮杂-8-氮杂鸟苷以及6-硫代-7-脱氮杂-8-氮杂鸟苷。6.如权利要求1所述的合成RNA分子，其中至少两个所述非规范核苷酸各包含小于20%的所述合成RNA分子。7.如权利要求1所述的合成RNA分子，其中所述非规范核苷酸包括: a.以下的至少一种:假尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、5-氮杂尿苷、5-羟基尿苷、5-氨基尿苷、5-甲基尿苷、2-硫代假尿苷、4-硫代假尿苷、5-羟基假尿苷、5-甲基假尿苷以及5-氨基假尿苷，以及 b.以下的至少一种:假异胞苷、5-甲基胞苷、N4-甲基胞苷、2-硫代胞苷、5-氮杂胞苷、5-羟基胞苷、5-氨基胞苷、N4-甲基假异胞苷、2-硫代假异胞苷、5-羟基假异胞苷、5-氨基假异胞苷以及5-甲基假异胞苷。8.如权利要求7所述的合成RNA分子，其中所述非规范核苷酸进一步包括以下的至少一种:N6-甲基腺苷、7-脱氮杂腺苷、6-硫代鸟苷、7-脱氮杂鸟苷、8-氮杂鸟苷、6-硫代-7-脱氮杂鸟苷、6-硫代-8-氮杂鸟苷、7-脱氮杂-8-氮杂鸟苷以及6-硫代-7-脱氮杂-8-氮杂鸟苷。9.一种合成RNA分子，其: a.包含非规范核苷酸，以及 b.编码基因编辑蛋白。10.一种治疗组合物,其包含如权利要求1至权利要求9中任一项所述的合成RNA分子。11.一种治疗组合物，其包含编码基因编辑蛋白的合成RNA分子和转染试剂。12.一种用于使用核酸转染细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与如权利要求1至权利要求9中任一项所述的合成RNA分子接触。13.一种用于诱导哺乳动物细胞表达感兴趣的蛋白质的方法，所述方法包括使所述细胞与如权利要求1至权利要求9中任一项所述的合成RNA分子接触。14.一种用于重新编程细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与如权利要求1至权利要求9中任一项所述的合成RNA分子接触。15.一种用于基因编辑细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与如权利要求1至权利要求9中任一项所述的合成RNA分子接触。16.一种用于使用核酸转染细胞的方法，所述方法包括: a.使所述细胞与含有氢化可的松和/或白蛋白的培养基接触，其中所述白蛋白用离子交换树脂或木炭处理，以及 b.使所述细胞与所述核酸接触。17.如权利要求16所述的方法，其中所述白蛋白用短链脂肪酸处理。18.如权利要求16所述的方法，其中使所述白蛋白达到至少40°C的温度。19.如权利要求16所述的方法，其进一步包括使所述细胞与转染试剂接触。20.如权利要求16所述的方法，其中所述细胞为哺乳动物细胞，并且所述哺乳动物细胞被诱导表达感兴趣的蛋白质。21.如权利要求16所述的方法，其进一步包括在连续5天期间使步骤(b)重复至少两次。22.如权利要求16所述的方法，其中所述核酸编码重新编程蛋白。23.如权利要求16所述的方法，其中所述细胞被重新编程。24.如权利要求23所述的方法，其中所述细胞为皮肤细胞，并且所述方法进一步包括在支持以下的至少一种生长的条件下培养所述皮肤细胞:皮肤细胞、多能干细胞、葡萄糖反应性胰岛素产生细胞、造血细胞、...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·安吉尔，C·罗德，
申请(专利权)人：菲克特生物科学股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US