本发明专利技术公开了一种获取体外转染成功的实体瘤细胞的方法，包括以下操作步骤：１）取对数生长期单细胞悬液，用有血清培养液３７℃培养２０ｈ；２）在无菌ＥＰ管中混合反义寡核苷酸；３）在另一支无菌ＥＰ管中混合脂质体，混匀后室温放置５ｍｉｎ；４）取上述反义寡核苷酸混合物和ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ？２０００混合物，混合均匀，室温放置２０ｍｉｎ，备用；５）转染。本发明专利技术有效地解决了体外转染技术无法稳定转染三维生长细胞团块内部细胞的问题，可以均匀的转染入待转染三维生长细胞中，从而达到最高的转染效率，最大限度的模拟相关分子在体内的功能。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种。
技术介绍
自从1885年从鸡胚中分离细胞首次建立体外培养细胞技术以来，单层贴壁细胞 培养技术在科学研究中得到广泛应用，但是，生命科学领域的科学研究，关注的不仅仅是它 们能否分裂生长，更重要的是生长起来的细胞是否能代表体内的真实情况。目前在体外对 于抗肿瘤药物的筛选和治疗效果的研究，大多数都是用单层贴壁生长的二维生长模型，而 这种生长方式与体内组织细胞所真实存在的状态有很大差异，这种差异就造成了二维生长 模型所得出的实验结论与动物实验及临床实验的不符。所以用三维立体空间生长的细胞模 型进行研究，能够更好地模拟体内的真实状况，所得出的实验结论也更加客观、可信，值得 将这种方法进行推广，因此近年来体外实验中越来越多的学者开始关注三维生长实体瘤细 胞的相关研究。但是由于三维生长实体瘤细胞聚集成团，体外转染过程中团块内部的细胞 很难接触到转染试剂，导致转染效率不高、实验结果不稳定。因此，急需一种转染效率高、结 果稳定可靠的对三维生长实体瘤细胞进行体外基因转染的方法。 由于肝癌的发病率高，预后差，称为癌中之王，而且在国内由于肝炎病毒的感染， 使得肝癌在国内的研究价值及其重大等原因，所以我们选取了肝癌作为代表性的实体瘤进 行研究，研究结果将能够进行其它实体瘤的进一步推广应用。反义核酸治疗是一项非常成 熟并且应用广泛的技术，FDA已经批准多种基因的反义药物进入临床。所以应用反义核酸技 术进行三维生长模型转染方式的探索，将具有较高的学术意义和推广应用价值。由于肝癌 的转移比肿瘤本身具有更高的致死率和严重后果，并且肝癌的微转移难以检测和控制，所 以选取能够控制肿瘤转移的基因作为靶点具有更重大的意义。目前的研究显示，转移过程 中的实体瘤也是聚集成团、三维生长的，该技术可以推广应用到对于转移瘤的控制和治疗。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术提供了一种可成功获取体外转染成功的实体瘤细胞的 方法，本专利技术的方法为首先体外转染二维生长细胞，待转染过程结束再使其生长为三维细 胞，即可得体外基因转染成功了的三维生长实体瘤细胞。本方法转染效率高，结果稳定可罪。 本专利技术是通过以下技术方案实现的 —种，包括以下操作步骤 1)取对数生长期单细胞悬液，用有血清培养液调整浓度为6X 107ml，取2mL接种于25mL培养瓶中，37。C培养20h ; 2)在无菌EP管中混合反义寡核苷酸取8 ii L PS-asODNs，加250 y L Optim MEM， 混匀； 3)在另一支无菌EP管中混合脂质体:取10ii L lipofectamine 2000，加250 ii LOptimMEM，混匀后室温放置5min ; 4)取上述反义寡核苷酸混合物和lipofectamine 2000混合物，混合均匀，室温放置20min，备用; 5)转染采取以下两种方式之一进行转染 取1)中的细胞，弃培养瓶中原来的培养液，加入2mL无血清培养液，继续培养6h后，胰蛋白酶消化细胞，用有血清培养液调整浓度为4X 105/ml，500 ii L每孔加入到24孔板中，孔底预先铺有Poly-HEMA，继续孵育24h后，收集细胞，即得转染后的三维生长实体瘤细胞； 或取l)中的细胞，继续培养6h后，胰蛋白酶消化细胞，用有血清培养液调整浓度为4X 105/ml， 500 ii L每孔加入到24孔板中，孔底预先铺有Poly-HEMA，继续孵育24h后，收集细胞，即得转染后的三维生长实体瘤细胞。 所述有血清培养液优选含10%胎牛血清的RPMI1640，所述无血清培养液优选无血清RPMI1640。 所述Poly-HEMA即为现有技术中已有的抗锚定培养板，其配制方法为用20mL95X的乙醇溶解2.4g Poly-HEMA粉末，65。C振荡混匀8h以上，制备成Poly-HEMA储存液，于4t:密封保存。用时用95%的乙醇按1 : 2.3的比例稀释成工作液，在无菌条件下将工作液沿孔壁轻轻加入培养板孔的底部至覆盖整个孔底，然后在超净台中紫外线照射过夜，即制得Poly-HEMA培养板，盖好盖子置于4°C ，可保存一周，用前在紫外灯下照射0. 5h，并用无菌PBS洗涤3遍。 为确定转染是否成功，转染后，检测三维生长实体瘤细胞的生物学活性、死亡率及转染效率。 所述检测维生长实体瘤细胞的生物学活性的具体方案为转染6h后消化细胞得到单细胞悬液，调整浓度为3 X 105/ml， 100ul/每孔接种到96孔板，继续培养24h后，使用CCK-8试剂盒检测细胞生物学活性每孔细胞中加入CCK-8作用液10 ii L，继续培养90min，于酶标仪450nm波长处测定0D值，计算细胞活性抑制率，与无关序列对照组相比差别明显者提示该基因在该细胞存活过程中发挥重要作用。 所述检测三维生长实体瘤细胞的死亡率的方案为转染6h后消化细胞得到的单细胞悬液，调整浓度为3X 105/ml， 100ul/每孔接种96孔板，继续培养24h后，每孔加台盼蓝50ul，染色5min，照相，然后用经胰蛋白酶消化成单个细胞后终止消化并镜下计数，计算细胞死亡率。死亡率是鉴定基因是否起重要作用的指标，死亡率与无关序列对照组相比差别有统计学意义，则认为该基因起重要作用。 所述检测三维生长实体瘤细胞的转染效率的方案为转染后，提取细胞总RNA，并通过逆转录反应获得cDNA，以获得的cDNA为模板，PCR扩增ANGPTL4和内参照基因P -actin ;然后进行Real-Time PCR，共6组，分别为空白对照组P -actin、空白对照组ANGPTL4，无关序列对照组P -actin、无关序列对照ANGPTL4、 ANGPTL4封闭组P -actin和ANGPTL4封闭组ANGPTL4，每组均做三管重复；反应条件为95 。C 10min，95。C 10sec，55°C 10sec，72。C 10sec共40循环，65°C 10sec，37。C 30sec。若转染组RNA受抑制程度明显高于对照组，即为转染成功。 本专利技术提供的获取体外基因转染成功的三维生长实体瘤细胞的方法可以应用于包括反义寡核苷酸在内的各类小分子物质，如小干扰RNA等转染进入三维生长实体瘤细胞的相关研究，可推广应用到①稳定筛选体外转染小分子物质的细胞系，然后对其进行三维立体培养以进一步深入研究相关分子的功能，这些分子可以是癌基因、导致肿瘤恶性增殖的基因，转移相关基因等，为最终有效治疗肿瘤和控制肿瘤奠定基础。②体外检测药物在体内无法发挥最大功效的原因，是由于细胞本身耐药还是由于药物无法到达体内成团细胞内部发挥作用所致，从而有的放矢的进行改良，提高各种疾病的药物治疗疗效。 本专利技术所建立的获取体外基因转染成功的三维生长实体瘤细胞的方法与常规的转染方法(常规的为先建立三维生长实体瘤细胞模型，再进行转染)相比，具有操作简单，不需要无血清转染，转染效率高，可重复性好等特点。本方法具有以下显著的特点和优势(1)本方法有效地解决了体外转染技术无法稳定转染三维生长细胞团块内部细胞的问题，可以均匀的转染入待转染三维生长细胞中，从而达到最高的转染效率，最大限度的模拟相关分子在体内的功能。(2)本方法可以推广应用到筛选通过本方法封闭相关分子或者外源性高表达相关分子的相关疾病细胞系，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种获取体外转染成功的实体瘤细胞的方法，其特征在于：包括以下操作步骤： １）取对数生长期单细胞悬液，用有血清培养液调整浓度为６×１０↑［５］／ｍｌ，取２ｍＬ接种于２５ｍＬ培养瓶中，３７℃培养２０ｈ； ２）在无菌ＥＰ管中混合反义寡核苷酸：取８μＬＰＳ－ａｓＯＤＮｓ，加２５０μＬ Ｏｐｔｉｍ ＭＥＭ，混匀； ３）在另一支无菌ＥＰ管中混合脂质体：取１０μＬ ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００，加２５０μＬ ＯｐｔｉｍＭＥＭ，混匀后室温放置５ｍｉｎ； ４）取上述反义寡核苷酸混合物和ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００混合物，混合均匀，室温放置２０ｍｉｎ，备用； ５）转染：采取以下两种方式之一进行转染：取１）中的细胞，弃培养瓶中原来的培养液，加入２ｍＬ无血清培养液，继续培养６ｈ后，胰蛋白酶消化细胞，用有血清培养液调整浓度为４×１０↑［５］／ｍｌ，５００μＬ每孔加入到２４孔板中，孔底预先铺有Ｐｏｌｙ－ＨＥＭＡ，继续孵育２４ｈ后，收集细胞，即得转染后的三维生长实体瘤细胞； 或：取１）中的细胞，继续培养６ｈ后，胰蛋白酶消化细胞，用有血清培养液调整浓度为４×１０↑［５］／ｍｌ，５００μＬ每孔加入到２４孔板中，孔底预先铺有Ｐｏｌｙ－ＨＥＭＡ，继续孵育２４ｈ后，收集细胞，即得转染后的三维生长实体瘤细胞。...
【技术特征摘要】
一种获取体外转染成功的实体瘤细胞的方法，其特征在于包括以下操作步骤1)取对数生长期单细胞悬液，用有血清培养液调整浓度为6×105/ml，取2mL接种于25mL培养瓶中，37℃培养20h；2)在无菌EP管中混合反义寡核苷酸取8μLPS-asODNs，加250μL Optim MEM，混匀；3)在另一支无菌EP管中混合脂质体取10μL lipofectamine 2000，加250μL OptimMEM，混匀后室温放置5min；4)取上述反义寡核苷酸混合物和lipofectamine 2000混合物，混合均匀，室温放置20min，备用；5)转染采取以下两种方式之一进行转染取1)中的细胞，弃培养瓶中原来的培养液，加入2mL无血清培养液，继续培养6h后，胰蛋白酶消化细胞，用有血清培养液调整浓度为4×105/ml，500μL每孔加入到24孔板中，孔底预先铺有Poly-HEMA，继续孵育24h后，收集细胞，即得转染后的三维生长实体瘤细胞；或取1)中的细胞，继续培养6h后，胰蛋白酶消化细胞，用有血清培养液调整浓度为4×105/ml，500μL每孔加入到24孔板中，孔底预先铺有Poly-HEMA，继续孵育24h后，收集细胞，即得转染后的三维生长实体瘤细胞。2. 根据权利要求1所述的获取体外转染成功的实体瘤细胞的方法，其特征在于所述 有血清培养液为含10%胎牛血清的RPMI1640，所述无血清培养液为无血清RPMI1640。3. 根据权利要求1所述的获取体外转染成功的实体瘤细胞的方法，其特征在于所述 Poly-HEMA即为抗锚定培养板。4. 根据权利要求1所述的获取体外转染成功的实体瘤细胞的方法，其特征在于转染 后，对得到的三维生长实体瘤细胞进行生物学活性检测，具体方案为转染6...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙汶生，韩丽辉，曹莉莉，梁晓红，杜娟，张之勇，曲忠花，刘玉刚，刘素侠，石永玉，高立芬，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：88[中国|济南]
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