一种流感病毒减毒活疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种流感病毒减毒活疫苗，保藏编号为CCTCCNO:V201302，其基于M基因的突变而制备获得，该疫苗候选株具有较好的基因稳定性，减毒特性，具有较强的免疫原性，不仅能够诱导流感病毒特异性血清抗体和粘膜抗体，也能够诱导产生T细胞的不同亚群和分泌IFN-γ的CD8+T细胞数量，在现有的生产能力和技术下，能够有效的扩大免疫人群，在流感大流行时具有重要的社会意义和使用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种流感病毒减毒活疫苗及其制备方法
本专利技术涉及生物制品领域，更具体地讲，涉及一种流感病毒减毒活疫苗及其制备方法。
技术介绍
流感病毒流行大致可以分为世界大流行、局部流行及散发三种。2009年4月以来，一种新型流感病毒（甲型H1N1）在墨西哥开始蔓延并迅速引起了世界范围内流感大流行[Mexicofludeathsraisefearsofglobalepidemic.MSNBC.2009-04-24.]。截止到2011年5月26日，在全世界范围内共造成了1,353,141人感染，死亡人数为15,934人。预防流感病毒流行的最有效的手段是疫苗接种。与传统的灭活疫苗相比，流感病毒减毒活疫苗具有较多优点，其保留了病毒原有的部分活性，在接种人群后能通过病毒在上呼吸道复制模拟自然感染，可以诱导机体产生更全面的免疫应答，使受试者获得更广泛有效的保护。同时减毒活疫苗能够在机体内存在较长时间，故引起有效免疫应答的时间更加强烈和持久长，更加难得的是一些减毒活疫苗能够诱导机体产生较强的交叉免疫反应，对表面抗原发生漂变的流行株病毒有一定的交叉保护作用。此外，其使用方法简便容易。现在，上市的流感病毒减毒活疫苗主要包括美国研制的冷适应减毒活疫苗和俄罗斯研制的减毒活疫苗。该疫苗在人的正常体温37℃时复制能力受到了极大的限制，对人不具有或具有较低的致病性能力，但是在25℃和33℃能进行有效的复制的流感病毒株，具有冷适应和温度敏感的特性[AmbroseCS,LukeC,CoelinghK.CurrentstatusofliveattenuatedinfluenzavaccineintheUnitedStatesforseasonalandpandemicinfluenza.InfluenzaOtherRespiViruses.2008,2(6):193-202.]。但是由于专利和知识产权的限制和保护，该类型的减毒活疫苗还没有在中国批准上市。流感病毒的基质蛋白，在其复制周期中发挥着重要的作用，基质蛋白M1是流感病毒颗粒中含量最多的蛋白，参与了病毒壳骨架的构成，此外其还能与病毒的RNA结合，与RNP复合体相互作用，在病毒的复制和感染中起着重要的作用[ShaB,LuoM.Structureofabifunctionalmembrane-RNAbindingprotein,influenzavirusmatrixproteinM1.NatStructBiol.1997,4(3):239-244.]。M2蛋白具有离子通道和调节膜内PH值的作用，该作用能够影响HA蛋白的构像，从而影响病毒的出芽和感染[TakeuchiK,LambRA.InfluenzavirusM2proteinionchannelactivitystabilizesthenativeformoffowlplaguevirushemagglutininduringintracellulartransport.JVirol.1994,68(2):911-919.]。基于以上理由，本专利技术研究了基于M基因突变制备流感病毒减毒活疫苗的方法和技术。
技术实现思路
本专利技术所要解决的第一个技术问题是，提供一种流感病毒减毒活疫苗。本专利技术所要解决的第二个技术问题是，提供一种流感病毒减毒活疫苗的制备方法。本专利技术所要解决的第三个技术问题是，提供突变的M基因在制备预防流感疫苗制剂中的应用。为了解决上述第一个技术问题，本专利技术提供了一种流感病毒减毒活疫苗，其保藏编号为：CCTCCNO:V201302。为了解决上述第二个技术问题，本专利技术提供了流感病毒减毒活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）从接种流感病毒的鸡胚尿囊液中抽提病毒的RNA，利用RT-PCR的技术制备cDNA，扩增流感病毒的基因片段，分别构建到表达质粒上；（2）M基因定点突变，构建到质粒上并测序验证，突变后的M基因序列如SEQIDNO.1所示；（3）突变的M基因质粒和未突变的其他基因质粒共同转染293T细胞；（4）细胞培养上清接种鸡胚，验证稳定性、减毒特性，以及安全性和有效性评价。作为一个优选方案，所述流感病毒为A型流感病毒。为了解决上述第三个技术问题，本专利技术提供了突变的M基因在制备预防流感疫苗制剂中的应用，其特征在于，所述突变的M基因序列如SEQIDNO.1所示。作为一个优选方案，所述疫苗制剂的免疫方式是经鼻腔免疫。作为又一个优选方案，所述流感病毒为A型流感病毒。本专利技术所要保护的流感病毒减毒活疫苗命名为甲型流感病毒InfluenzaVirusAM-PR8（下称M-PR8），保藏在中国典型培养物保藏中心（保藏地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学中国典型培养物保藏中心邮编430072），保藏日期为2013年3月5日，保藏编号为CCTCCNO:V201302。本专利技术的有益效果：本专利技术提供了一种流感病毒减毒活疫苗，基于M基因的突变而制备获得，该疫苗候选株具有较好的基因稳定性，减毒特性，具有较强的免疫原性，诱导机体强烈的免疫应答，不仅能够诱导流感病毒特异性血清抗体和粘膜抗体，也能够诱导产生T细胞的不同亚群和分泌IFN-γ的CD8+T细胞数量，在现有的生产能力和技术下，能够有效的扩大免疫人群，在流感大流行时具有重要的社会意义和使用价值。附图说明图1：本专利技术实施的技术路线图。图2：对比M-PR8和PR8流感病毒在MDCK细胞上的生长水平，分别在MDCK细胞上接种0.001MOI的PR8和M-PR8，分别收获接种后24h，48h,72h,96h的样本，使用半数组织感染剂量的方法检测各个样本的病毒滴度。*表示与PR8组比较有显著性差异（P＜0.05）。图3：肺部病毒滴度，每组3只6-8周龄小鼠，滴鼻接种20μl105TCID50剂量MPR8或PR8病毒液，3天后处死小鼠，使用2ml的PBS(含0.1%BSA)冲洗气管-肺泡，使用半数组织感染剂量的方法检测各个样本的病毒滴度，*表示与PR8组比较有显著性差异（P＜0.05）。图4:不同剂量的M-PR8疫苗免疫三周后，检测其脾细胞中IFN-γ的分泌水平。每组3只6-8周龄小鼠，分别滴鼻接种20μl10TCID50,100TCID50，1000TCID50剂量M-PR8病毒液，对照组滴鼻接种20μl的PBS，21天后处死小鼠，分离脾细胞，使用ELISPOTassay检测脾细胞中IFN-γ的分泌水平，*表示与对照组比较有显著性差异（P＜0.05）。图5:分析疫苗免疫后的小鼠的脾细胞中CD3+CD4+T细胞的频率，A,阴性对照；B,10TCID50免疫组；C,100TCID50免疫组；D,1000TCID50免疫组。图6：分析疫苗免疫后的小鼠的脾细胞中CD3+CD8+T细胞的频率，A,阴性对照；B,10TCID50免疫组；C,100TCID50免疫组；D,1000TCID50免疫组。图7:不同剂量的M-PR8免疫小鼠在10×LD50剂量的同源病毒PR8致死攻击后体重变化。图8:不同剂量的M-PR8免疫小鼠在10×LD50剂量的同源病毒PR8致死攻击后的存活率。图9:不同剂量的M-PR8免疫小鼠在10×LD50剂量的异源病毒H9N2致死攻击后体重变化。图10:不同剂量的M-PR8免疫小鼠在10×L本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种流感病毒减毒活疫苗，其保藏编号为：CCTCC NO:V201302。

【技术特征摘要】
1.一种流感病毒减毒活疫苗，其保藏编号为：CCTCCNO:V201302。2.权利要求1所述流感病毒减毒活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)从接种A型流感病毒的鸡胚尿囊液中抽提病毒的RNA，利用RT-PCR的技术制备cDNA，扩增流感病毒的基因片段，分别构建到表达质粒上；(2)M基因定点突变，构建到质粒上并测序验证，突变后的M基因序列如SEQIDNO.1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈则，易应磊，
申请(专利权)人：上海生物制品研究所有限责任公司，
类型：发明
国别省市：上海;31