具有运铁蛋白肽的外切体制造技术

本发明专利技术涉及在其表面上包括运铁蛋白靶向部分的外切体，产生它们的方法，和此类外切体用于体内递送遗传物质和/或生物治疗性蛋白或肽或化疗试剂的用途，尤其涉及此类外切体在基因疗法或基因沉默、或递送其他治疗剂的方法中的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有运铁蛋白肽的外切体
[〇〇〇1] 本专利技术涉及将外切体靶向期望的细胞类型或组织。具体而言，本专利技术涉及外切体， 和产生它们的方法，所述外切体包括在外切体的表面上表达的靶向部分。
技术介绍
核酸常规上用于基因疗法用于替换非功能基因[1]，并且经RNA干扰（RNAi)效应 器分子比如miRNAs[2]、 ShRNAs[3]和siRNAs[4]用于抵消致病的突变。由于快速清除[5]、 核酸酶[6]、缺乏器官特异性分布和低效的细胞摄取，裸露DNA和RNA难以在体内递送，通常 专用的基因递送载体用于递送。 病毒载体和阳离子脂质体是最前沿的递送载体技术并且已经是相对成功的，大量 的这些递送载体已经在临床试验中[7]。尽管这些成功，仍有明显的局限限制许多应用，最 显著的局限是对于大部分病毒载体的免疫识别[8,9,10]和对于病毒比如慢病毒的诱变整 合[11];和炎症毒性和对于脂质体的快速清除[12,13,14,15]。通过先天免疫系统的识别 导致急性炎症反应，其可需要使用免疫抑制策略以克服现有策略潜在地将患者暴露于机会 性感染的冒险的摄取和再施用问题[16,17,18]。针对递送媒介产生的抗体也使得在随后的 施用中转基因表达急剧地减少[19]。 现有策略的固有风险和限制已经通常将它们限于治疗的益处明显超过风险的威 胁人类生命的疾病，比如重症联合免疫缺陷[20]，限于特定环境比如类似眼的免疫豁免部 位中的疾病[1]，或用于基因接种[21]。但是，对于慢性的和使人虚弱但不是危及生命的遗 传疾病，比如肌强直性营养不良，需要相当更低的风险特征并且维持矫正基因治疗的能力 几十年，不是几年，用于治疗介入。对于次类疾病潜在地不可接受的风险的例子是以上讨论 的免疫抑制策略，突出的是由于试验管理员未知的对象服用的免疫抑制剂[22]引起的机 会性感染，在最近的风湿性关节炎的AAV基因治疗试验中健康患者的死亡。随着逐渐增多 数量的疾病显示具有遗传成分，包括肥胖、心脏疾病和精神疾病，有很大的可能性修饰易感 基因用于预先的遗传方案，但是仅仅如果风险进一步下降并且实现长期的维持能力。因此， 需要开发这样的技术，其能够避免免疫识别和炎症，同时保留好的递送效率，以便扩展基因 疗法在致死疾病之外的用途。 方案之一可能在于使用特异性靶向待治疗的细胞类型或器官的外切体用于基因 递送。外切体是内吞起源的小膜结合囊泡（30-100nm)，其在多泡体与质膜融合之后释放进 入细胞外环境。已经对许多免疫细胞，包括B细胞、T细胞和树突细胞（DC)描述了外切体 产生。衍生自B淋巴细胞和成熟DC的外切体表达MHC-II、MHC-I、⑶86和ICAM-1 [23, 24]， 并且在实验模型和临床试验中已经用于诱导特定的抗肿瘤T细胞毒素应答和抗肿瘤免疫 [24, 25]。外切体介导的基因递送的潜能已经由递送鼠 mRNAs和miRNAs至人肥大细胞显示 [26]，并且神经胶质瘤衍生的外切体[27]已经表明将外源DNA质粒产生的mRNA转移至异 源细胞。也已经公开了具有外源DNA、siRNA和其他修饰寡核苷酸的外切体[28]。
技术实现思路
本专利技术人也已成功地将靶向部分引入外切体，从而外切体可被靶向所选择的组 织。尤其，本专利技术人已成功地将运铁蛋白（Tf)肽靶向部分引入外切体，从而外切体可被靶 向表达运铁蛋白受体（TfR)的组织或细胞。本专利技术人已经显示表达Tf肽靶向部分的外切 体具有与商业上可获得的常规的转染试剂比如lipofectamine和RNAi max相当的摄取效 率。因此，本专利技术涉及在表面上包括Tf肽靶向部分的外切体、包括外切体跨膜蛋白和靶向 部分的融合蛋白，并且涉及编码此类融合蛋白的核酸构建体。Tf靶向外切体可用货物比如 外源遗传物质或生物治疗性蛋白和/或肽、和/或化疗试剂装载并且用于货物的递送，尤其 用于核酸的递送用于基因治疗和基因沉默，以及生物治疗性蛋白和肽和化疗试剂的递送用 于治疗。 根据本专利技术的一个方面，提供了包括外切体的组合物，其中外切体包括在外切体 的表面上表达的靶向部分，并且所述靶向部分是运铁蛋白（Tf)多肽或肽。Tf多肽靶向部分 或Tf肽靶向部分可以是保留与TfR结合的能力的任何Tf多肽或Tf肽。 在另一方面中，本专利技术提供包括外切体的组合物，其用于体内递送遗传物质、蛋白 质和/或肽的方法中，该外切体包括在外切体的表面上表达的Tf多肽靶向部分或Tf肽靶 向部分，其中该外切体衍生自不成熟的树突细胞。 在另一方面中，本专利技术提供产生外切体的方法，该外切体包括在外切体的表面上 表达的Tf多肽靶向部分或Tf肽靶向部分，该方法包括在用于产生外切体的细胞中表达包 括靶向部分和外切体跨膜蛋白的融合蛋白，其中随着该细胞产生融合蛋白，表达的融合蛋 白并入外切体。 在另一方面中，本专利技术提供包括外切体跨膜蛋白和异源靶向蛋白、多肽或肽的多 肽，其中靶向蛋白、多肽或肽是与在待靶向的细胞表面上存在的TfR结合的Tf多肽或Tf 肽，并且其中当多肽存在于外切体中时，该靶向Tf多肽或Tf肽存在于外切体的表面上。 在另一实施方式中，本专利技术提供编码多肽的多核苷酸构建体，其中该构建体包括 编码5'外切体跨膜信号序列的多核苷酸，例如内质网靶向信号肽，其可操作地连接至编码 本专利技术多肽的多核苷酸。 在另一实施方式中，本专利技术提供将外切体靶向所选择的组织或细胞类型的方法， 所述方法包括用根据本专利技术的多核苷酸构建体转染宿主细胞，在宿主细胞中表达构建体， 和从已经表达该构建体的宿主细胞中获得外切体。 【附图说明】 图1.用外切体介导的siRNA递送敲低GAPDH: (a，b)是将Cy5-标记的GAPDH siRNA应用至具有电穿孔的（E)非靶向的外切体（Exo非靶向的）、Tf-靶向的外切体（Exo Tf)或RVG靶向的外切体（Exo RVG)的HEK细胞的代表性图像。添加非电穿孔的外切体和 siRNA (NE)作为阴性对照并且添加 siRNA和常规的转染试剂（LIP0和RNAi max)作为阳性 对照。 图2.用外切体介导的siRNA递送敲低GAPDH: (a，b)是将Cy5-标记的GAPDH siRNA 应用至具有电穿孔的（E)非祀向的外切体（Exo非祀向的）、Tf-祀向的外切体（Exo Tf) 或RVG靶向的外切体（Exo RVG)的B2M17细胞的代表性图像。添加非电穿孔的外切体和 siRNA(NE)作为阴性对照并且添加 siRNA和常规的转染试剂（LIPO和RNAi max)作为阳性 对照。 图3.用外切体介导的siRNA递送敲低GAPDH: (a，b)是将Cy5-标记的GAPDH siRNA 应用至具有电穿孔的（E)非祀向的外切体（Exo非祀向的）、Tf-祀向的外切体（ExoTf)或 RVG靶向的外切体（Exo RVG)的脑神经瘤细胞（Neur〇2a)的代表性图像。添加非电穿孔的 外切体和siRNA (NE)作为阴性对照并且添加 siRNA和常规的转染试剂（LIP0和RNAi max) 作为阳性对照。 图4.用外切体介导的siRNA递送敲低GAPDH: (a，b)是将Cy5-标记的GAPDH siRNA 应用至具有电穿孔的（E)非祀向的外切体（Exo非祀向的）、Tf本文档来自技高网...

【技术保护点】
包括外切体的组合物，其中所述外切体包括在所述外切体的表面上表达的靶向部分，并且所述靶向部分是运铁蛋白(Tf)多肽或肽。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.12.07 GB 1121069.71. 包括外切体的组合物，其中所述外切体包括在所述外切体的表面上表达的靶向部 分，并且所述靶向部分是运铁蛋白（Tf)多肽或肽。2. 根据权利要求1所述的组合物，其中所述Tf多肽包括与SEQ ID NO: 1具有至少80% 序列同一性的多肽序列或所述Tf肽来自所述多肽。3. 根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述Tf肽包括来自SEQ ID NO: 1的所述多 肽序列的至少10个连续氨基酸残基。4. 根据前述权利要求任一项所述的组合物，其中所述肽选自：CRTIGPSVC(SEQIDN0:3) 或PSDGPSV(SEQ ID N0:4)。5. 根据前述权利要求任一项所述的组合物，其中所述靶向部分包括与存在于待靶向的 细胞上的部分结合的肽。6. 根据权利要求5所述的组合物，其中所述存在于待靶向的细胞上的部分是运铁蛋白 受体（TfR)。7. 根据权利要求5或6所述的组合物，其中所述外切体包括外切体跨膜蛋白，其已经被 修饰以并入所述肽靶向部分。8. 根据权利要求7所述的组合物，其中所述外切体跨膜蛋白选自Lamp-1、Lamp-2、 CD13、CD86、Flotillin、Syntaxin_3〇9. 根据权利要求8所述的组合物，其中所述外切体跨膜蛋白是Lamp-2b。10. 根据权利要求9所述的组合物，其中所述靶向部分存在于Lamp-2b的N-末端处或 其附近并且用接头序列与Lamp-2b分开。11. 根据前述权利要求任一项所述的组合物，其中所述外切体衍生自树突细胞。12. 根据前述权利要求任一项所述的组合物，其中所述外切体用外源遗传物质、蛋白质 和/或肽或化疗剂装载。13. 根据权利要求12所述的组合物，其中所述外源遗传物质是编码治疗性蛋白或免疫 原的DNA质粒。14. 根据权利要求12所述的组合物，其中所述外源遗传物质是siRNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·伍德斯，S·拉卡尔利特雷顿，S·伊兰德鲁斯，
申请(专利权)人：ISIS创新公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB