本发明专利技术公开了一种鱼类败血病病原维氏气单胞菌减毒活疫苗及其应用，其将野生型维氏气单胞菌通过基因改造导入一种特异性肽适体SNP‑L1，使其毒力减弱，得到维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)减毒株L1，利用该减毒株L1制备的活疫苗通过腹腔注射斑马鱼，后期免疫保护率可达65％，可有效预防鱼类细菌性败血病的发生，具有一定的应用价值和减毒活疫苗的开发前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种鱼类细菌性败血病病原维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)减毒活疫苗及其应用。
技术介绍
自改革开放以来，我国水产养殖业发展迅速，取得了瞩目的成就，2014年全年水产品产量6450万吨，比上年增长4.5％。但是人们过于追求经济效益，不断扩大养殖规模，养殖密度增大，以及一些不科学地管理养殖模式，导致水产养殖细菌病害频发，严重限制水产养殖业的快速稳定发展。其中由维氏气单胞菌引起的细菌性病害在水产养殖业中很常见。它是一种革兰氏阴性杆状细菌，一般从临床、自然环境和食品中分离获得，能够侵染多种水产养殖动物，如虾，鲫鱼、中华绒螯蟹、团头鲂、泥鳅、锦鲤等，严重危害我国水产养殖业的发展。同时对人类健康安全也造成威胁，它能够引起人类伤口感染，腹泻及免疫功能低下患者的败血症。目前，水产养殖业中主要采用药物防控细菌病害，如大量使用广谱抗生素等化学药物进行防治。然而，抗生素在长期使用过程中容易导致病原菌耐药性增强、药物残留、生态环境污染以及危害人类健康等诸多问题，很难实现我国水产养殖业的可持续健康发展。相对于化学药物，疫苗可以安全有效预防鱼类传染性疾病的发生，是当前鱼类细菌性疾病防控的最有效方法。但相对于人用和兽用疫苗，鱼用疫苗很少，尤其关于维氏气单胞菌减毒活疫苗目前在国内外尚未见报道。
技术实现思路
鉴于现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种鱼类细菌性败血病病原维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)减毒活疫苗及其应用。为了实现本专利技术的目的，专利技术人经过大量试验研究筛选特异性肽适体，并将特异性肽适体通过细菌三亲接合方式导入到野生型毒株维氏气单胞菌中，从而获得了一种维氏气单胞菌减毒活疫苗。具体地，本专利技术的技术方案概况如下：一种维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)减毒株L1，保藏在中国微生物菌种保藏
管理委员会微生物中心(保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；邮编100101)，保藏日期为2015年12月23日，保藏编号为CGMCC No.11922。本专利技术所述的维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)减毒株L1，它是将能表达特异性肽适体SNP-L1的pRE112质粒导入野生型维氏气单胞菌后而得，所述的特异性肽适体SNP-L1的氨基酸序列如序列表中序列1所示。本专利技术还提供了一种特异性肽适体SNP-L1，其氨基酸序列如序列表中序列1所示。另外，本专利技术还提供了一种编码上述特异性肽适体SNP-L1的核苷酸序列。优选地，编码上述特异性肽适体SNP-L1的核苷酸序列为序列表中序列2所示。进一步地，本专利技术还提供了一种含有上述特异性肽适体SNP-L1的重组质粒pRE112-SNP-L1；以及提供了一种含有该重组质粒pRE112-SNP-L1的宿主。最后，本专利技术还提供了上述维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)减毒株L1在制备预防鱼类免受维氏气单胞菌侵染方面的减毒活疫苗中的应用。与现有技术相比，本专利技术对野生型毒株维氏气单胞菌导入含有特异性肽适体SNP-L1的质粒pRE112-SNP-L1后制备维氏气单胞菌减毒株L1，其相对于野生毒株具有明显的低生长能力和低毒性，具有免疫保护能力，对鱼种的免疫保护率可达65％，可有效保护鱼种免受维氏气单胞菌野生毒株的侵染。所获得的维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)减毒株L1添加佐剂被制备成疫苗并免疫鱼类后，对鱼类具有较好的免疫保护效果，能够有效防控野生型毒株维氏气单胞菌的感染。附图说明图1为PCR扩增SNP-L1片段的电泳检测图，其中M为DSTM 5000 Marker；1号为SNP-L1片段。图2为PCR扩增pk18mobSacB质粒上的npt II的启动子区及pTRG-SNP-L1质粒上的SNP-L1片段的电泳检测图，其中M为DSTM 5000 Marker；1号为npt II片段；2号为SNP-L1片段。图3为融合片段电泳图，其中M为DSTM 5000 Marker；1号为npt II启动子片段和SNP-L1的融合片段。图4为筛选pRE112-SNP-L1阳性克隆子电泳图，其中2、4、8、10号为阳性克隆子。图5为PCR验证是否细菌三亲结合成功的电泳检测图，其中M为DSTM 5000 Marker；1-2号为成功导入pRE112-SNP-L1的维氏气单胞菌；3为空白对照。图6为用野生型毒株维氏气单胞菌和减毒株维氏气单胞菌A.veronii L1的PCR检测，其中a-b图分别为取生理盐水组的斑马鱼麻醉致死后，以及用野生型毒株维氏气单胞菌和减毒株维氏气单胞菌A.veronii L1腹腔注射后死亡的斑马鱼，取腹腔组织液在LB加氨苄青霉素固体平板上划线；d图为对在a-b中在LB加氨苄青霉素固体平板上培养的菌落进行菌落PCR验证，其中M为DSTM 5000 Marker；1-2号为注射野生型毒株维氏气单胞菌后死亡的斑马鱼组织液；3号为空白对照；4-5为注射减毒株维氏气单胞菌A.veronii L1后死亡的斑马鱼组织液；6号为空白对照。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。实施例1维氏气单胞菌减毒活疫苗的制备1、构建pTRG-SNP-L1重组质粒1)PCR扩增SNP-L1片段PCR反应体系(50μl)：1×SNP F 1:5’-CGCGGATCCATGGGTTACCCATACGACGTTC-3’SNP R1:5’-CCGCTCGAG TTATCAGCGTTGTCTTCAGAC-3’PCR反应条件：PCR运行结束后用1％琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统拍照(见图1)。2)PCR产物回收利用上海捷瑞生物工程有限公司的PCR产物纯化试剂盒(离心柱型)进行PCR产物纯化回收，用30μl ddH2O洗脱。3)SNP-L1PCR纯化产物双酶切其双酶切体系如下：25μl掌型离心机上瞬间离心10sec混匀，37℃酶切5h。然后过柱回收纯化，用30μlddH2O洗脱。4)“靶”空载体pTRG双酶切其双酶切体系如下：25μl掌型离心机上瞬间离心10sec混匀，37℃酶切5h。然后取1U CIP 37℃处理30min。然后过柱回收纯化，用30μl ddH2O洗脱。5)连接反应按照载体：基因片段摩尔比为1:3的比例，使用T4DNA ligase进行4℃过夜酶连，酶连反应体系如下：10μl掌型离心机上瞬间离心10sec混匀，4℃冰箱过夜酶连。可以暂时放在-20℃保存。6)制备E.coli XL1-Blue MRF’感受态细胞及热激转化1)采用化学方法0.1M CaCl2制备E.coli XL1-Blue MRF’感受态细胞。验证好感受态细胞质量之后，取10μl连接产物加到100μl感受态细胞中，轻柔吹打混匀，冰上静置30min，不时轻柔旋转；2)42℃水浴热激90sec，立即放置冰上冷却2min；3)加入900μl 37℃预热的LB液体培养基，混匀，37℃150rpm振荡培养1h；本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)减毒株L1，其保藏编号为：CGMCC No.11922。
【技术特征摘要】
1.一种维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)减毒株L1，其保藏编号为：CGMCC No.11922。2.根据权利要求1所述的维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)减毒株L1，其特征在于，它是将能表达特异性肽适体SNP-L1的...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘鹏，刘柱，章跃陵，胡新文，唐燕琼，唐鸿倩，
申请(专利权)人：海南大学，
类型：发明
国别省市：海南;46
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