一种鱼类烂鳃病病原约氏黄杆菌减毒活疫苗及构建方法技术

本发明专利技术公开了一种鱼类烂鳃病病原约氏黄杆菌减毒活疫苗及构建方法。本发明专利技术将野生型约氏黄杆菌通过链霉素连续传代诱导突变致其毒力减弱，得到约氏黄杆菌减毒突变株M170，利用该减毒株制备的活疫苗通过注射、浸泡免疫草鱼、鳜鱼等免疫保护率均可达73.1%以上，免疫保护期达8个月以上，具有免疫剂量小、效价高、保护率高、保护期长等优点，且可通过浸泡方式进行免疫，可预防草鱼、鳜鱼等细菌性烂鳃病的发生，具有良好应用价值和广阔市场前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种鱼类烂鲍病病原约氏黄杆菌（/7ZaraAacieriiffl? JbAfl1SOfliae)减毒 活疫苗及构建方法。
技术介绍
中国是水产养殖大国，水产养殖产量占全球总产量的70%。随着我国水产养殖业的 快速发展，养殖规模的扩大以及单位产量的提高，病害问题日益凸显。其中由黄杆菌引起的 细菌性烂鳃病是水产养殖中最常见的疾病之一，具有危害养殖品种多、发病率高、发病范围 广、流行时间长等特点，每年给我国水产养殖业带来严重的经济损失，打击了渔民的生产积 极性，带来药物残留等水产品质量安全问题，制约了我国水产养殖业的可持续健康发展。 目前国内对于鱼类细菌性烂鳃病主要采用消毒剂、抗生素等化学药物进行治疗， 然而化学药物的大量使用，导致耐药菌株的出现，对水产品质量安全和生态安全造成不利 影响。疫苗免疫接种作为符合环境友好和可持续发展战略的病害防控措施，已成为国际现 代水产养殖业的标准生产规范内容之一。黄杆菌主要寄生在鱼体的鳃组织，鱼体的防御作 用主要通过局部的粘膜免疫来实现，而灭活疫苗、亚单位疫苗等由于缺乏主动粘附能力， 故其免疫效果不确定，因此黄杆菌减毒活疫苗成为鱼类细菌性烂鳃病疫苗研发的重点。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种约氏黄杆菌减毒活疫苗。 本专利技术的另一个目的在于提供一种约氏黄杆菌减毒活疫苗的构建方法。 本专利技术的另一个目的在于提供上述约氏黄杆菌减毒活疫苗的应用。 本专利技术所采取的技术方案是： 一种约氏黄杆菌减毒突变株的构建方法，将约氏黄杆菌野生株M168在含逐渐升高浓 度的链霉素的培养基中培养，直至培养到培养基中链霉素浓度为128 μ g/mL，所得转化菌株 为约氏黄杆菌减毒突变株。 -种约氏黄杆菌减毒突变株的构建方法，将约氏黄杆菌野生株rpsL基因编码蛋 白的86位点由精氨酸突变为色氨酸。优选将约氏黄杆菌野生株rpsL基因编码蛋白的86 位点的密码子由AGG突变为TGG。 所述约氏黄杆菌野生株为约氏黄杆菌野生株M168。 由以上所述的方法制备得到的氏黄杆菌减毒活疫苗。 约氏黄杆菌减毒突变株M170,其保藏编号为CCTCC NO :M 2015112,保藏单位为： 中国典型培养物保藏中心。 以上约氏黄杆菌减毒突变株在制备预防鱼类烂鳃病制剂中应用。 一种用于预防鱼类烂鳃病的疫苗制剂，其含有以上所述的约氏黄杆菌减毒突变 株。 本专利技术的有益效果是： 本专利技术采用链霉素连续传代诱导，建立了一种鱼类烂鳃病病原黄杆菌减毒活疫苗构建 方法。采用该方法制备得到的约氏黄杆菌减毒活疫苗，具有免疫剂量小、效价高、保护率高、 保护期长等优点，且可通过浸泡方式进行免疫，可预防草鱼、鱖鱼等细菌性烂鳃病的发生， 具有良好应用价值和广阔市场前景。【附图说明】 图1为两株约氏黄杆菌的溶血活性实验结果图； 图2为约氏黄杆菌减毒活疫苗浸泡免疫鱖鱼后溶菌酶基因表达动力学图； 图3为约氏黄杆菌疫苗免疫草后抗体滴度动力学图。【具体实施方式】 下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明，但并不局限于此。 实施例 -、约氏黄杆菌减毒突变株的诱导 从患烂鳃病的淡水鱼中分离病原约氏黄杆菌菌株（M168)，经平板划线纯化培养后用灭 菌等渗盐水将菌液浓度调整成IO7CFU / mL备用。在M-H肉汤培养基中分别添加0.005、 0· 01、0· 02、0· 03、0· 06、0· 13、0· 25、0· 5、1、2、4、8、16、32、64、128 μ g / mL 的链霉素，配制成 不同链霉素浓度的培养基。取10 UL上面制备的菌悬液接种于2 mL含0.005 yg / mL链 霉素的肉汤培养基中，28°C温育24 h后如有细菌生长，将其转接于含0.01 μ g/mL链霉素 的培养基中，28°C温育24 h后如有细菌生长，转接下一浓度链霉素培养基中，如未见细菌 生长，在上一浓度链霉素培养基中继续培养，直至能在下一浓度中链霉素培养基中可以生 长，如此反复，最终诱导获得能在链霉素浓度为128 μ g/mL培养基中稳定生长的约氏黄杆 菌（/7ZaraAacieriaw jbAasofliae)减毒突变株M170。将其保藏于中国典型培养物保藏中心 (CHINA CENTER FOR TYPE CULTURE COLLECTION，CCTCC)，地址为中国，武汉，武汉大学，保藏 编号为CCTCC NO :M 2015112,保藏日期为2015年3月15日。 每传代一次采用PCR方法对菌株rpsL基因变异情况进行监测，结果显示当传代至 链霉素浓度为32 μ g/mL时rpsL基因编码86位氨基酸由精氨酸突变为色氨酸（R86W)。 二、约氏黄杆菌减毒突变株的性状鉴定及分子生物学信息 1、胞外产物的制备及胞外酶活性检测 分别挑取斜面保存的菌株M168和菌株M170的单菌落接种于CYE液体培养基中，置于 恒温培养箱中，摇床（180r/min)培养20h。4°C下10000r/min离心30min，上清液经孔径为 0.22Mm微孔滤膜过滤，获得约氏黄杆菌ECP (Extracellular product，ECP)，4°C冰箱保存 备用。 分别用蒸馏水配制含脱脂牛奶（10%)、酪蛋白（1%)、明胶（1. 0%)、蛋黄（2. 5%)、可 溶性淀粉（〇. 2%)、吐温80 (1. 0%)、尿素（2. 0%)酚红指示剂等7种琼脂平板（pH值7. 5)。平 板打孔后分别加入2〇μL 2种约氏黄杆菌的ECP，加等量生理盐水（0. 65%)作阴性对照，每个 处理设3个重复。放入湿盒28°C恒温孵育48h。向脱脂牛奶平板和酪蛋白平板中加入10 % (w/ V)三氯乙酸溶液，向明胶平板中加入0.1mol/L酸性氯化汞溶液，向可溶性淀粉平板 中加入鲁哥氏碘液，以出现透明圈（脱脂牛奶、酪蛋白、明胶、可溶性淀粉平板）或者无透明 圈（蛋黄、吐温80平板）或者红色(尿素平板）者为阳性反应。 在培养相同时间后，两株约氏黄杆菌酶活实验结果表明，菌株M168和M170菌有蛋 白酶、酪蛋白酶、明胶酶、脂酶和淀粉酶活性，无卵磷脂酶活性；菌株M168还具有脲酶活性， 而菌株M170无脲酶活性。2株菌的酶活性圈大小也有一定的差别，具体见表1。 表1菌株M168和M170保外产物酶活性比较【主权项】1. 一种约氏黄杆菌减毒活疫苗的构建方法，其特征在于，将约氏黄杆菌野生株在含逐 渐升高浓度的链霉素的培养基中培养，直至培养到培养基中链霉素浓度为128yg/mL，所得 转化菌株为约氏黄杆菌减毒突变株。2. -种约氏黄杆菌减毒活疫苗的构建方法，其特征在于，将约氏黄杆菌野生株rpsL基 因编码蛋白的86位点由精氨酸突变为色氨酸。3. 根据权利要求2所述的约氏黄杆菌减毒活疫苗的构建方法，其特征在于，优选将约 氏黄杆菌野生株rpsL基因编码蛋白的86位点的密码子由AGG突变为TGG。4. 根据权利要求1-3任一项所述的约氏黄杆菌减毒活疫苗的构建方法，其特征在于， 所述约氏黄杆菌野生株为约氏黄杆菌野生株M168。5. 约氏黄杆菌减毒活疫苗，其特征在于，其是由权利要求1-4任一项所述的方法制备 得到的。6. 约氏黄杆菌减毒突变株M170,其保藏编号为CCTCCNO:M2015112,保藏单位本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种约氏黄杆菌减毒活疫苗的构建方法，其特征在于，将约氏黄杆菌野生株在含逐渐升高浓度的链霉素的培养基中培养，直至培养到培养基中链霉素浓度为128μg/mL，所得转化菌株为约氏黄杆菌减毒突变株。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李宁求，林强，付小哲，刘礼辉，郭慧芝，吴淑勤，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院珠江水产研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44