一种鸡常见细菌病的病原多重PCR检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种鸡常见细菌病的病原多重PCR检测试剂盒，所述的试剂盒包括PCR反应液以及多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7 和金黄色葡萄球菌这4 种细菌的特异性引物，阳性对照（多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7 和金黄色葡萄球菌标准品或多杀性巴氏杆菌

【技术实现步骤摘要】
一种鸡常见细菌病的病原多重PCR检测试剂盒
本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种鸡常见细菌病的病原多重PCR检测试剂盒，还涉及该试剂盒的使用方法。
技术介绍
大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和多杀性巴氏杆菌是鸡生长过程中常见的细菌性疾病的病原。它们不仅严重危害我国养禽业的发展，而且大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌还可以通过食品污染感染人类，给人类健康造成威胁。大肠杆菌(E.Coli)O157:H7是肠出血性大肠杆菌的一个主要菌型，能引起人畜共患病，其潜在的暴发流行趋势、强烈的致病性、致死性，使其对养殖业及人类安全有极大的危害。沙门氏菌(Salmonella)是人畜共患病病原菌，极易产生耐药性，对养殖业危害严重，在引起人类食源性疾病的病原菌中占首位。多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida)是引起人和动物接触性、烈性细菌传染病(又称禽霍乱、出血性败血症)的条件致病菌，其高发病率和死亡率，对养殖业影响严重，被列为重点防制的家禽疫病之一，近几年有病例逐渐增多的趋势。金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是动物化脓感染、交叉感染最常见的病原菌，有“嗜肉菌”的别称，是目前养鸡生产中危害最严重的疾病之一。同时我国法律对上述细菌(巴氏杆菌除外)在食品中的数量有严格的限定。目前针对养殖场细菌病的检测，主要依赖于细菌学培养，一般耗时4-7d，检测方法比较繁琐、费时，要同时检测分离养殖场多种致病菌及混合感染情况较麻烦。免疫印迹技术、酶联免疫吸附法、核酸杂交技术、PCR技术等因其特异性强、敏感性高、操作简单快速而被广泛应用，但这些方法通常每次只能检测一种病原菌。多重PCR(MultiplexPCR)是在常规PCR基础上改进并发展起来的一种新型DNA扩增技术，是在同一反应体系中同时加入多对引物扩增多条目的DNA片段，可实现多种病原微生物同时检测。多重PCR技术的优势在于可以对病原进行快速、全面、系统、准确的检测与鉴定，并且操作和普通PCR一样简单，所以可以大大提高检测效率、缩短检测周期、降低检测成本，特别适合成组病原体的检测，具有显著的经济效益和社会效益。本专利技术旨在建立一种四重PCR快速检测方法，实现对大肠杆菌0157：H7、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌引起的四种人畜共患传染病的同步快速检测，对流行病调查及有效进行畜禽疫病监测防控、提高公共卫生安全具有一定意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供了一种鸡常见细菌病的病原多重PCR检测试剂盒，该试剂盒由多重PCR反应液、阳性对照以及阴性对照品组成。以往在家禽中检测病原菌大多通过细菌的分离鉴定或运用针对单个菌的PCR检测，本检测试剂盒针对鸡细菌病最常见的4种细菌，设计并筛选出互不干扰的4对检测引物，检测4种病原菌在一个反应中完成，更为高效，且敏感性好，特异性强，检测下限达到0.01ng/μL。本专利技术还有一个目的是在于提供了一种鸡常见细菌病的病原多重PCR检测试剂盒的使用方法，方法简单，快速，所有检测步骤可在4小时内完成。为了实现上述目的，本专利技术采取以下技术措施：一种鸡常见细菌病的病原多重PCR检测试剂盒，包括多重PCR反应液(TaqDNA聚合酶、不含Mg2+的PCR反应缓冲液、Mg2+、dNTPs)，多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7和金黄色葡萄球菌这4种细菌的特异性引物(如表1所示)，阳性对照(多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7和金黄色葡萄球菌标准品或多杀性巴氏杆菌KMT1基因、沙门氏菌invA基因、大肠杆菌O157:H7rfbE基因和金黄色葡萄球菌nuc基因的阳性质粒)，阴性对照(灭菌的无酶双蒸水)、DNAMarker。表1多重PCR特异性引物序列表一种鸡常见细菌病的病原多重PCR检测试剂盒的使用方法，其步骤如下：1、样品的处理与DNA模板的提取：感染早期肠道是以上4种致病菌的主要寄生部位，活禽取样主要通过采集肛门棉拭子，死禽可取肠道内容物，肉制品可直接取小块组织。提取样品的基因组DNA，取2μL(20ng)作为待测样品。每次检测均应设立阳性对照和阴性对照。2、反应体系与反应条件：反应体系如下(总体积25μL)：反应条件：预变性94℃4min；变性94℃30s，退火56℃30s，延伸72℃45S，共循环30次；终延伸72℃10min，。PCR产物鉴定：取8μLPCR扩增产物加2μL6×LoadingBuffer混匀，以DL2000DNAMarker作为相对分子质量指示，用1.8％琼脂糖凝胶(含EB0.03μL/mL)在100V电压下电泳30min，置凝胶成像系统中进行结果分析。3、结果的判断：(1)质控标准阴性对照：点样孔对应的泳带上无条带；阳性对照：点样孔对应的泳带上有4条明显的阳性条带：大肠杆菌O157:H7扩增的阳性片段678bp(500-700bp之间)、沙门氏菌284bp(略高于250bp)、多杀性巴氏杆菌460bp(接近500bp)、金黄色葡萄球菌229bp(低于250bp)；如果阴性对照或者阳性对照有一项不符合标准则本次检测无效。(2)判定结果检测样品孔对应的泳道上无条带，结果判定为阴性；检测样品孔对应的泳道上出现≤4条泳带，与标准阳性孔对应的条带进行比较，如果条带在一条直线上，对应的细菌检测结果判断为阳性；如果不在一条直线上或检测孔的泳道上出现≥5条泳带，可能试验过程污染，建议重做。本专利技术与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：1、目前，养殖业临床病例多种疾病交叉感染、混合感染的情况屡见不鲜，甚至有越来越复杂的势态，但检测畜禽细菌性临床病例及进行流行病学调查主要采取细菌分离鉴定法，需多个检测步骤，操作复杂、耗时费力，并且一次只能检测一种病原菌。本研究建立的多重PCR检测方法克服了以上的不足，细菌培养后，完成同时检测大肠杆菌O157：H7、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌四种病原菌的任务，只需大约4h，有较好的特异性和敏感性(检测下限可达10pg/uL)，比传统的细菌学方法简便经济，有较大的应用价值。2、多重PCR反应体系中存在多对引物和多个模板，任意两者均存在发生相互作用的情况，造成假阳性的出现，因此引物的设计成为多重PCR检测方法建立的关键因素，本专利技术提供的检测引物确保不同引物对之间、引物与非靶序列之间没有同源关系，扩增的四条目的基因片段长度亦有一定差距，并使琼脂糖凝胶在一定的浓度范围内，保证电泳时目的条带能明显区分。3、本专利技术提供的试剂盒可用于鸡等活禽肛拭子的检测，有利于临床的推广。本试剂盒也可用于肉制品加工过程中的细菌污染检测。该试剂盒为养殖业以及食品卫生中以上四种细菌的检测与防控提供了有效的工具与方法，准确率高达92.6％。附图说明图1为本专利技术所述的多重PCR检测试剂盒内单一引物的特异性检测结果注：A为大肠杆菌O157引物的特异性检测结果；B为沙门氏菌引物的特异性检测结果；C为多杀性巴氏杆菌引物的特异性检测结果；D为金黄色葡萄球菌引物的特异性检测结果。图2为本专利技术所述的多重PCR检测试剂盒内四种细菌引物混合特异性检测结果注：A为检测一种细菌的特异性扩增结果；B为检测两种细菌的特异性扩增结果；C为检测三种细菌的特异性扩增结本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鸡常见细菌病的病原多重PCR检测试剂盒，包括PCR反应液、阳性对照、阴性对照、特异性引物及DNA Marker，其特征在于：所述的特异性引物为rfbE‑F 5′‑AACGGTTGCTCTTCATTTAG‑3′rfbE‑R 5′‑GAGACCATCCAATAAGTGTG‑3′invA‑F 5′‑TCATCGCACCGTCAAAGGAACC‑3′invA‑R 5′‑GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA‑3′KMT1‑F 5′‑ATCCGCTATTTACCCAGTGG‑3′KMT1‑R 5′‑GCTGTAAACGAACTCGCCAC‑3′nuc‑F 5′‑AGATAACGGCGTAAATAGAAGTGG‑3′nuc‑R 5′‑TGCACTTGCTTCAGGACCATA‑3′所述的阳性对照为：大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌的标准品或大肠杆菌O157:H7rfbE基因阳性质粒、沙门氏菌invA基因阳性质粒、多杀性巴氏杆菌KMT1基因阳性质粒、金黄色葡萄球菌nuc基因阳性质粒；所述的阴性对照为灭菌的无酶双蒸水。

【技术特征摘要】
1.一种鸡常见细菌病的病原多重PCR检测试剂盒，包括PCR反应液、阳性对照、阴性对照、特异性引物及DNAMarker，其特征在于：所述的特异性引物为rfbE-F5′-AACGGTTGCTCTTCATTTAG-3′rfbE-R5′-GAGACCATCCAATAAGTGTG-3′invA-F5′-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3′invA-R5′-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3′KMT1-F5′-ATCCGCTATTTACCCAGTGG-3′KMT1-R5′-GCTGTAAACGAACTCGCCAC-3′nuc-F5′-AGATAACGGCG...

【专利技术属性】
技术研发人员：谷长勤，张晓茜，程国富，张万坡，胡薛英，谢长清，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42