新孢子虫减毒活疫苗制造技术

得自新孢子虫（Ｎｅｏｓｐｏｒａ）种病原亲本株的一株的细胞培养物，该细胞与亲本株的细胞相比表现出减弱的病原性，但当作为活疫苗被施用时能够激发保护哺乳动物抗新孢子虫病的免疫应答。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及致病原生动物新孢子虫(Neospora)的减毒株以及抗新孢子虫病(neosporosis)的活疫苗，所述疫苗是由减毒株制备得到的，它可用于预防哺乳动物的临床疾病和流产。新孢子虫是动物的致病性原生动物寄生虫，近来人们已认识到它是哺乳动物流产、新生儿死亡、先天感染和脑疾病的主要致病原。Dubeyand Lindsay，1993，Parasitology Today，9452-458。犬新孢子虫(N.caninum)感染狗，并先天性地感染幼犬，经常导致瘫疾。已从自然感染的幼犬中分离到犬新孢子虫的tachyzoite。Lindsay andDubey，1989，J.Parasitol.75163-165。新孢子虫是致使奶牛流产的主要原因，在山羊、绵羊和马中也报道了与新孢子虫相关的疾病的例子，即新孢子虫病。尽管犬新孢子虫在表面上与病原体即鼠弓形体(Toxoplasmagondii)相似，但从抗原和超微结构上仍可以将犬新孢子虫和鼠弓形体互相区分开。Dubey and Lindsay，1993，文献同上。而且，从流产的牛胎儿脑中分离新孢子虫样的原生动物寄生虫，接着在体外培养，显示出它在抗原和超微结构上与鼠弓形体和Hammondia hammondi都有所不同，而与犬新孢子虫最相似。Conrad等，1993，Parasitology106239-249。另外，对核的小亚单位核糖体RNA基因的分析表明在分离自牛和狗的新孢子虫之间没有核苷酸的差异，但它们与鼠弓形体相比显示出一致的差异。Marsh等.，1995，J.Parasitol.81530-535。牛流产和先天疾病的新孢子虫牛分离物的病原学作用已被证实。Barr等.，1994，J.Vet.Diag.Invest.6207-215。使用被犬新孢子虫感染的近交BALB/c小鼠已开发出中枢神经系统新孢子虫病的啮齿动物模型。Lindsay等.，1995，J.Parasitol.81313-315。另外，Cole等.，1995，J.Parasitol，81730-732和Long等.，1996，J.Parasitol.82608-611分别描述了研究怀孕的远系繁殖和近交小鼠中犬新孢子虫穿过胎盘传染的模型。而且，与自然获得的新孢子虫诱导的牛流产很相似的实验性的犬新孢子虫矮小山羊模型已被阐明。Lindsay等.，1995，Am.J.Vet.Res 561176-1180。WO9525541公开了牛新孢子虫的生物学纯培养物，检测抗新孢子虫抗体和新孢子虫特异性核酸的方法以及含有牛新孢子虫抗原和载体以用作疫苗的组合物。然而，WO9525541未教导新孢子虫的减毒活培养物，或者由此制备的能够在接种动物中激发保护性免疫应答的活疫苗。第一方面，本专利技术提供了得自新孢子虫种病原亲本株的一株的细胞培养物，该细胞与亲本株的那些细胞相比表现出减弱的病原性，但是当作为活疫苗施用时能够激发保护哺乳动物抗新孢子虫病的免疫应答。第二方面，本专利技术提供了保护哺乳动物抗新孢子虫病的疫苗，它含有免疫有效量的得自新孢子虫种病原亲本株的一株的活细胞和兽医学可接受的载体，该细胞与亲本株的那些细胞相比表现出减弱的病原性，但是当作为活疫苗施用时能够激发保护哺乳动物抗新孢子虫病的免疫应答。本专利技术的疫苗也可以进一步含有一种或多种其他成分，包括例如佐剂。本专利技术的疫苗可以施用给对新孢子虫引起的感染和疾病敏感的任何哺乳动物种，包括但不限于狗、奶牛、山羊、绵羊和马。第三方面，本专利技术提供了由新孢子虫的病原株制备减毒细胞培养物的方法，该培养物用于保护哺乳动物抗新孢子虫病的疫苗中，所述方法包括修饰得自新孢子虫种病原亲本株的细胞；选择并克隆繁殖一个或多个与亲本株细胞相比表现出减弱的病原性的经修饰细胞；并选择和克隆繁殖一个或多个当在活疫苗中被施用时能够激发保护哺乳动物抗新孢子虫病的免疫应答的减毒细胞。第四方面，本专利技术提供了保护哺乳动物抗新孢子虫病的疫苗的制备方法，所述方法包括修饰得自新孢子虫种病原亲本株的细胞；选择并克隆繁殖那些与亲本株细胞相比表现出减弱的病原性但是当在活疫苗中被施用时能够激发保护哺乳动物抗新孢子虫病的免疫应答的经修饰细胞；并以适于作为活疫苗施用给哺乳动物的形式将免疫有效量的减毒细胞与兽医学可接受的载体相组合。第五方面，本专利技术提供了给哺乳动物接种以抗新孢子虫病的方法，所述方法包括给哺乳动物施用免疫有效量的疫苗，该疫苗含有得自新孢子虫种病原亲本株的一株的活细胞和兽医学可接受的载体，所述细胞与那些亲本株细胞相比表现出减弱的病原性，但是当作为活疫苗施用时能够激发保护哺乳动物抗新孢子虫病的免疫应答。第六方面，本专利技术提供了联合疫苗，它含有免疫有效量的得自新孢子虫种病原亲本株的一株的活细胞，该细胞与那些亲本株细胞相比表现出减弱的病原性，但是当作为活疫苗施用时能够激发保护哺乳动物抗新孢子虫病的免疫应答；一种或多种可激发保护哺乳动物抗病或病原状态的免疫应答的其他抗原；和兽医学可接受的载体。联合疫苗可进一步含有一种或多种其他成分，包括例如佐剂。本申请人已发现新孢子虫种的病原株的细胞可以被减毒，所得减毒细胞当作为活疫苗施用时可以激发保护哺乳动物抗新孢子虫病的免疫应答。本专利技术因此提供了得自新孢子虫种病原亲本株的一株的细胞培养物，该细胞与那些亲本株细胞相比表现出减弱的病原性，但当它作为活疫苗被施用时能够激发保护哺乳动物抗新孢子虫病的免疫应答。本专利技术进一步提供了在疫苗中使用的新孢子虫种减毒细胞培养物的制备方法，所述疫苗可保护哺乳动物以抗新孢子虫病，所述方法包括修饰得自新孢子虫种病原亲本株的细胞，例如，通过严格连续传代或者暴露于诱变剂或者使用重组DNA技术的基因工程；选择并克隆繁殖一个或多个与亲本株细胞相比表现出减弱的病原性的经修饰细胞；并选择和克隆繁殖一个或多个当在活疫苗中被施用时能够激发保护哺乳动物抗新孢子虫病的免疫应答的减毒细胞。本文所用术语“新孢子虫病”是指哺乳动物由新孢子虫种或株引起的感染，或是指与哺乳动物被新孢子虫感染相关的任何临床症状，状况，事件或病理学。本文所用术语“减毒的”描述了与减毒细胞、培养物或株所来源的新孢子虫亲本株相比，体外或体内的感染性或毒力表现出可测降低的新孢子虫细胞、培养物或株。毒力的降低包含任何毒力标志的任何可测的降低，包括体外或体内的感染性，或者包含与感染相关的任何临床症状或状况的严重性或进展速率的任何降低。术语“亲本株”指的是当施用于哺乳动物时，与通过一次或多次体内或体外传代和/或一个或多个减毒步骤由其得到的减毒株相比，表现出相对高水平病原性的新孢子虫株。本专利技术进一步包含新孢子虫株细胞疫苗的制备和使用，所述新孢子虫株得自对特殊的哺乳动物种无致病性的株或种，但该细胞被化学或遗传方法修饰过，从而在该哺乳动物种的成员中都能激发保护性的免疫应答。本专利技术的活的减毒细胞在作为活疫苗被施用一次或多次后，能够激发保护哺乳动物抗新孢子虫病的免疫应答。“保护性免疫应答”的定义是任何免疫反应，或者是抗体或者是细胞介导的免疫力，或者两者都有，它们出现在哺乳动物中或者防止或者可检测地降低随后的感染，或者消除或者可检测地降低严重性，或者可检测地延缓与新孢子虫病相关的一种或多种临床症状或状况进展的速率。术语“免疫有效量本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：D·A·布拉克，B·L·布拉本，D·S·林德塞，
申请(专利权)人：辉瑞大药厂，奥本大学，
类型：发明
国别省市：