本发明专利技术提供一种共转染CYP3A4和MDR1细胞模型的构建，是先将P-gp的基因克隆到pcDNA3.1(+)上，转染MDCK细胞，经过G418筛选出单克隆细胞，得到MDCK-MDR1细胞株，然后将CYP3A4克隆到带有潮霉素B筛选标记的载体pcDNA3.1(+)/Hygro上，转染MDCK-MDR1细胞，经过潮霉素B筛选，得到共转染CYP3A4和MDR1细胞。MDCK-MDR1/CYP3A4被中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCCC2011119，保藏日期：2011年12月15日。本发明专利技术构建的模型，可用于模拟药物载肠道的吸收和代谢过程，进而筛选P-gp和CYP3A4共同底物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属生物
，涉及共转染药物代谢酶CYP3A4和转运体MDRl细胞模型的构建及用途。
技术介绍
口服给药是临床上最为常用的给药方式之一。口服后药物通常在小肠部位被吸收，透过小肠壁进入人体血液循环，到达靶部位而发挥疗效。小肠是药物吸收进入血液这一过程中主要的生理屏障。新药研发中，候选化合物在小肠中的透过性可影响口服药物的生物利用度，是决定化合物能否成为新药的关键因素之一。目前广泛应用的肠道模型为Caco-2细胞(人结肠癌上皮细胞)，但Caco-2细胞并不能完全模拟人体肠道模型，因为它不能产生粘液且只表达极少量的细胞色素P450酶 (CYP450)。Crespi等用含有人CYP3A4基因的P220. 2载体转染Caco-2细胞，而使其CYP3A4 的表达量比未转染的细胞高100倍。但该细胞系中CYP3A4的活性会在传代过程中以3-4 周为半衰期而丢失。Cynthia Brimer等以pcDNA3. I和pR印10为载体将CYP3A4基因转入 LLC-PKl细胞(猪肾上皮细胞)以获得高表达CYP3A4的细胞系。但LLC-PKl细胞作为肠道体外模型也存在一些缺陷和不足，缺少肠道上重要的转运蛋白。膜转运蛋白对药物的吸收、排泄甚至是代谢，都起着至关重要的作用。它可以保护细胞免受外来毒性物质侵害。1968年，Kessell等首次报导小鼠白血病细胞系中具有多药耐药(MDR)现象。Bielder和Reiehm在1970年就首次提出MDR的概念。1976年， Juliano和Ling在中国仓鼠卵巢细胞突变体细胞膜上发现了一种与MDR有关的糖蛋白，即 P-gp (P-glycoprotein,P-糖蛋白)，Genbank 编号为 NM_000927。P_gp 是一种跨膜糖蛋白， 由mdr基因编码，属于ABC转运蛋白超家族，是具有1280个氨基酸，相对分子量170kDa的膜蛋白。P-gp的二级结构包括12个穿越细胞膜区，2个ATP结合/利用位点。它分为两部分，每一部分均包括6个跨膜螺旋折叠组成的疏水区和一个ATP结合/利用位点的亲水区。 Aller等人在2009年首次P-gp的晶体结构，为转运蛋白的研究跨进很大一步。在人体中， 有外排作用的P-gp由MDRl基因编码。P-gp分布广泛,一般位于小肠、肝细胞、结肠和胆小管等组织的柱上皮细胞，肾脏近端小管的刷状缘，脑部的毛细管内皮细胞。这种极化的定位，有利于它发挥作用，抑制外源物吸收、帮助其消除或者保护敏感组织(如脑或胎儿)与外源物的接触。小肠上存在的多种药物外排蛋白其中最为主要的一种即P-gp。人细胞色素P450 (CYP)是广泛存在于生物体中的一类蛋白超家族，是一种含有铁卟啉辅基的b族细胞色素。CYP450细胞色素超家族中根据同源性不同被划分为多个家族和亚族，其中CYP1A2，2B6，2C9，2D6，和3A4被认为对于大部分药物的代谢相较于其他I相氧化酶贡献最多。人CYP3A家族包括CYP3A4，3A5，3A7，和3A43，其中CYP3A4在肝脏( 40% )和肠道中含量最高，代谢超过50%的临床使用药物。它参与了大多数药物的代谢并导致其首过作用，从而使药物的生物利用度降低，其中CYP3A4为其主要的亚型。。人类的 CYP3A4基因位于第7号染色体q22. 1，包括13个外显子及12个内含子，cDNA长度为1512个碱基，Genbank编号为NM017460。CYP3A4的晶体结构已于2004年得到解析，现在已经得到了 CYP3A4单独和与药物结合的多种晶体结构(蛋白数据库1W0E)。MDCK(Madin-Darby canine kidney)细胞系为马丁达比狗肾上皮细胞发展的一种细胞间连接非常紧密的细胞系，低水平表达转运蛋白，低代谢活性。MDCK细胞被认为是在遗传学方面以及在细胞的脂质、蛋白质组成方面较为理想的上皮细胞系。此外，MDCK细胞很大的一个优点就是培养周期短，只要3 5天即能成熟(Caco-2则要21天)，这样可以大大缩短实验周期，提高效率。Caco-2和MDCK之间有很好的相关性，因此常用MDCK细胞作为肠道模型研究药物在肠道的吸收情况。MDCK-MDR1细胞系是由MDCK细胞稳定转染人源MDRl基因，极性过表达P-gp的细胞系，它所表达的P-gp是位于极性细胞膜的一侧。早在1988年，Pasten等用人类的MDRl基因稳定转染MDCK细胞建立了一个能大量表达P_gp 的细胞系。用MDRl转染MDCK细胞建立的MDCK-MDR1细胞表达产生的P_gp主要是位于单层细胞细胞膜的顶侧，Caco-2和MDCK-MDR1细胞用于药物转运实验所得到的一些参数也比较一致，因此，MDCK-MDR1细胞作为模拟药物肠道吸收模型比MDCK细胞更优越。由于肠道中，除了参与药物转运的P-gp外，还存在参与药物代谢的CYP3A4， MDCK-MDR1细胞只能用于筛选评价药物的吸收特性，不能反映药物在肠道的代谢情况。因此，有必要建立MDRl和CYP3A4的双转染细胞模型，用于筛选和评价药物在肠道的吸收和代谢性质。目前，没有稳定共转染MDRl与CYP3A4的细胞模型，因此将MDRl与CYP3A4共转染至MDCK细胞，获得既稳定高表达P-gp又有高代谢活性的转基因细胞，作为一个更完善的体外肠道模型来研究研究药物的跨膜转运和体外代谢都有重大的研究意义，同时对了解药物在肠道的吸收情况有实际指导作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种共转染药物代谢酶CYP3A4和转运体MDRl的细胞模型的构建方法，主要是先将P-gp的基因MDRl克隆到pcDNA3. I (+) (invitrogen)上，转染MDCK 细胞(ATCC)，经过G418筛选出单克隆细胞，得到MDCK-MDR1细胞株，然后将CYP3A4克隆到带有潮霉素B筛选标记的载体pcDNA3. I (+) /Hygro (invitrogen)上,转染MDCK-MDR1细胞， 经过潮霉素B筛选，得到共转染CYP3A4和MDRl细胞。犬肾细胞MDCK-MDR1/CYP3A4目前已由中国典型培养物保藏中心(武汉大学)保藏；地址中国武汉武汉大学；保藏日期2011 年12月15日；培养物名称犬肾细胞MDCK-MDR1/CYP3A4，保藏编号为=CCTCC C2011119。本专利技术的共转染CYP3A4和MDRl细胞模型通过以下方法构建(I)将MDCK细胞以IO5/孔种于六孔板，培养48小时，用Lipofectamine 2000试剂(invitrogen)将表达载体pcDNA3. I (+)/MDRl转染MDCK细胞，方法参考转染试剂说明书，转染24小时后换液，并加G418进行筛选，以浓度600ug/mL筛选96小时后升至800ug/ mL筛选24小时，(2)将存活的细胞转移至培养瓶内培养，以600ug/mL的浓度培养二十天左右，按有限稀释法接种于96孔板，获得抗性单克隆，通过在mRNA，蛋白等水平检测，筛选出活性较高的MDCK-MDR1细胞，(3)将MDCK-MDR1细胞以相同的密度种植于6孔板中，当细胞达50-70%汇合时进行转染,使用Lipofectamine LTX转染试剂(invitrogen)将表达载体 pcDNA本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：曾苏，刘瑶，胡海红，余露山，蒋惠娣，周慧，徐思云，王鹭，何新，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
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