一种高效快速适配体筛选方法技术

本发明专利技术提供一种高效快速筛选适配体的方法，以髓系分化抗原CD33位靶标，在筛选时先进行六轮阴性筛选去除非特异性结合，再进行阳性筛选，筛选出能够特异性结合髓系分化抗原CD33蛋白的核酸适配体。并且通过流式细胞术验证了筛选出的适配体具有特异性以及高亲和性。本发明专利技术方法设计合理，采用293T细胞作为筛选的阴性细胞，转染CD33质粒的293T细胞作为阳性细胞进行适配体的筛选，最终快速高效地筛选出具有特异性的核酸适配体。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属生物制药领域，具体涉及一种新型的高效快速适配体筛选方法。
技术介绍
目前，恶性肿瘤已成为严重危害人类生命健康的常见疾病,并且发展为三大致死疾病之一，研究并开发治疗恶性肿瘤疾病的药物也成为当前首要任务。细胞毒类抗肿瘤药物是目前治疗恶性肿瘤的主要手段之一，但此类药物在杀灭或抑制肿瘤细胞的同时，也会对机体的正常细胞(尤其是代谢旺盛的细胞)产生影响，通常在药效剂量下就会导致病人出现不良反应,从而极大的限制了该类药物的进一步应用和发展。抗体偶联药物作为大分子靶向治疗的代表药物，目前已成功应用于临床治疗不同类型的肿瘤疾病(例如CD30-MMAE和T-DM1)。但由于抗体偶联药物其价格昂贵且不稳定，其替代药物核酸适配体(Aptamer)的研发则成为未来的必然趋势。核酸适配体(又称化学抗体)，具有精准的靶向性。核酸适配体能够快速而有效地分辨出靶分子结构上的细微差别，仅识别与其互补的空间结构，并与之结合，但其本身对肿瘤细胞不具备较强的杀伤力。另外，我国已发现近几百种具有抗肿瘤活性的海洋毒素，但由于其毒性反应过强而使药物开发中断。核酸适配体与海洋毒素偶联药物，即毒性药物与核酸适配体相连接组成靶向适配体偶联物，可以将药物“精确”地运送到靶细胞，既有效地提高了肿瘤局部的药物浓度，又可极大地降低体内其它组织、器官的毒性，从而达到真正靶向增效减毒的作用。从随机DNA配基文库中，通过指数富集的配体系统进化(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，SELEX)技术筛选Aptamers是目前Aptamers的主要获得途径。但总结发现，目前已知的Cell-SELEX、Protein-SELEX、CE-SELEX等筛选方法，具有筛选周期较长、亲和性较差且失败率较高等缺点，十分不利于Aptamers的发展和应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于高效快速筛选适配体的方法，通过以下步骤实现：将HEK-293T细胞种于六孔板汇总，待六孔板中HEK-293T细胞生长至90％，将第一个孔上层培养基吸出，用洗涤缓冲液洗涤两次(缓慢加入500μl洗涤培养基，轻轻摇晃并吸出，以防细胞脱落)；再加入预处理过的ssDNA文库，置于4℃冰箱内的水平摇床上，4℃、15rpm孵育30min。然后，将ssDNA文库从上一个孔吸出，加入预先洗涤两次的第二个孔中，4℃、15rpm孵育30min。方法同上，直至阴性筛选六轮后，吸出待用。将HEK-293T细胞瞬转质粒，48h后作为阳性细胞，用洗涤缓冲液洗涤细胞两次(缓慢加入500μl洗涤培养基，轻轻摇晃并吸出，防止细胞脱落)；将阴性筛选六轮后的ssDNA文库缓慢加入阳性细胞中，4℃、15rpm孵育30min。孵育完毕后，用洗涤缓冲液，缓慢洗涤细胞三次，再加入无DNA酶水500μl，用细胞刮刀将细胞收集入1.5ml离心管中。95℃加热10min重悬ssDNA，再13000g离心5min收集筛选后的ssDNA文库。将第一轮筛选得到的ssDNA文库进行PCR扩增、酶切纯化后，干燥用做下一轮筛选文库，循环至筛选结束，筛选出具有特异性的核酸适配体。本专利技术采用293T细胞作为筛选的阴性细胞，转染CD33质粒的293T细胞作为阳性细胞进行适配体的筛选。洗涤缓冲液：4.5gGlucose，1nMMgCl25ml，用DPBS溶解并定容至1L。本专利技术采用所述适配体筛选方法，以髓系分化抗原CD33位靶标，经过两轮的筛选，筛选出能够特异性结合髓系分化抗原CD33蛋白的核酸适配体。并且通过流式细胞术验证了筛选出的适配体具有特异性以及高亲和性。本专利技术的特点是在筛选时先进行六轮阴性筛选去除非特异性结合，再进行阳性筛选，最终快速高效地筛选出具有特异性的核酸适配体。附图说明图1是筛选过程中每一轮文库流式细胞术亲和性评价结果。图2是适配体S30与S28亲和性分析。具体实施方式本专利技术结合附图和实施例作进一步的说明。实施例1：靶向髓系分化抗原CD33核酸适配体的筛选1、缓冲液的配置洗涤缓冲液(4℃保存，有效期为30天)：4.5gGlucose，1nMMgCl25ml，用DPBS溶解并定容至1L。结合缓冲液(4℃保存，有效期为30天)：4.5gGlucose，1nMMgCl25ml，100mgtRNA，1gBSA，用DPBS溶解并定容至1L。2、细胞株的准备(购自中科院上海细胞库)阴性细胞株：HEK-293T细胞阳性细胞株：HEK-293T细胞瞬转CD3348h3、ssDNA文库的准备将4ODssDNA文库稀释至500μl结合缓冲液中，涡旋并于95℃加热5min后冰上骤冷并置于冰上待用。4、阴性筛选(反筛)待六孔板中HEK-293T细胞生长至90％，将第一个孔上层培养基吸出，用洗涤缓冲液洗涤两次(缓慢加入500μl洗涤培养基，轻轻摇晃并吸出，以防细胞脱落)；再加入预处理过的ssDNA文库，置于4℃冰箱内的水平摇床上，4℃、15rpm孵育30min。然后，将ssDNA文库从上一个孔吸出，加入预先洗涤两次的第二个孔中，4℃、15rpm孵育30min。方法同上，直至阴性筛选六轮后，吸出待用。5、阳性筛选(正筛)HEK-293T细胞瞬转CD33，48h后作为阳性细胞，用洗涤缓冲液洗涤细胞两次(缓慢加入500μl洗涤培养基，轻轻摇晃并吸出，防止细胞脱落)；将阴性筛选六轮后的ssDNA文库缓慢加入阳性细胞中，4℃、15rpm孵育30min。孵育完毕后，用洗涤缓冲液，缓慢洗涤细胞三次，再加入无DNA酶水500μl，用细胞刮刀将细胞收集入1.5ml离心管中。95℃加热10min重悬ssDNA，再13000g离心5min收集筛选后的ssDNA文库。6、PCR扩增PCR反应体系(μl)：两步扩增法500μl-800μl-1500μl扩增步骤：将500μl模板5个循环扩增至800μl。取其中50μl再次扩增至100μl，每扩增3个循环取样跑核酸胶，选择最优循环数。将剩余DNA作为模板按照最优循环数扩增至1500μl体系。PCR反应体系(μl)：PCR反应条件(3stepRxn)7、DNA纯化收集汇总PCR反应液，对DNA进行纯化。DNA纯化方法同ssDNA的纯化。8、测量ssDNA的浓度9、ssDNA的制备酶切后，纯化ssDNA，干燥用做下一轮筛选文库。循环三轮后，将每一轮的文库利用PCR扩增的方法带上荧光标签，收集HL60细胞，用流式本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高效快速筛选适配体的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：将HEK‑293T细胞种于六孔板汇总，待六孔板中HEK‑293T细胞生长至90％，将第一个孔上层培养基吸出，用洗涤缓冲液洗涤两次；再加入预处理过的ssDNA文库，置于4℃冰箱内的水平摇床上，4℃、15rpm孵育30min，然后，将ssDNA文库从上一个孔吸出，加入预先洗涤两次的第二个孔中，4℃、15rpm孵育30min，重复以上方法，直至阴性筛选六轮后，吸出待用；将HEK‑293T细胞瞬转质粒，48h后作为阳性细胞，用洗涤缓冲液洗涤细胞两次；将阴性筛选六轮后的ssDNA文库缓慢加入阳性细胞中，4℃、15rpm孵育30min，孵育完毕后，用洗涤缓冲液，缓慢洗涤细胞三次，再加入无DNA酶水500μl，用细胞刮刀将细胞收集入1.5ml离心管中，95℃加热10min重悬ssDNA，再13000g离心5min收集筛选后的ssDNA文库，将第一轮筛选得到的ssDNA文库进行PCR扩增、酶切纯化后，干燥用做下一轮筛选文库，循环至筛选结束，筛选出具有特异性的核酸适配体。

【技术特征摘要】
1.一种高效快速筛选适配体的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：将HEK-293T细胞
种于六孔板汇总，待六孔板中HEK-293T细胞生长至90％，将第一个孔上层培养基吸出，用洗
涤缓冲液洗涤两次；再加入预处理过的ssDNA文库，置于4℃冰箱内的水平摇床上，4℃、
15rpm孵育30min，然后，将ssDNA文库从上一个孔吸出，加入预先洗涤两次的第二个孔中，4
℃、15rpm孵育30min，重复以上方法，直至阴性筛选六轮后，吸出待用；将HEK-293T细胞瞬转
质粒，48h后作为阳性细胞，用洗涤缓冲液洗涤细胞两次；将阴性筛选六轮后的ssDNA文库缓
慢加入阳性细胞中，4℃、15rpm孵育30min，孵育完毕后，用洗涤缓冲液，缓慢洗涤细胞三...

【专利技术属性】
技术研发人员：那仁满都拉，杨畅，付玉洁，黄萍，葛明华，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33