一种特异识别细菌脂多糖的广谱核酸适配体及其定向筛选方法技术

本发明专利技术提供一条能识别多种不同革兰氏阴性菌来源的脂多糖广谱性核酸适配体。该核酸适配体是基于免标记靶标分子、固定化核酸文库的capture‑SELEX技术基础上定向筛选获得的。即以鼠伤寒沙门氏菌脂多糖为唯一靶标，利用生物素‑亲和素作用将随机寡核苷酸文库通过生物素化的短互补链固定在亲和素包被的Fe

【技术实现步骤摘要】
一种特异识别细菌脂多糖的广谱核酸适配体及其定向筛选方法
本专利技术涉及食品安全与检测、临床医学等领域，特别涉及到利用分子生物学技术中的SELEX技术(指数富集的配体系统进化技术)定向筛选一条脂多糖的广谱性核酸适配体，它能特异识别鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、大肠杆菌及铜绿假单胞菌等4种细菌来源的脂多糖，为该核酸适配体在食品、药品及生物制品中脂多糖的分析检测、分离富集和毒性中和等方面的应用提供科学依据和理论基础。
技术介绍
脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)，又名内毒素(Endotoxin)，是革兰氏阴性菌细胞壁外膜的主要成分。它主要由LipidA，核心多糖和O-特异性多糖重复单元三部分组成，其中LipidA是脂多糖的活性和毒性中心，位于外模的内侧，具有高度的保守型，而决定LPS抗原性的O-特异性多糖链位于外膜的外层，暴露于细胞表面，结构不稳定，核心多糖则位于两者中间，起连接作用。不同细菌来源的脂多糖结构不尽相同，毒性也不同，但是均具有相似的LipidA结构。LPS在体内可通过细胞信号转导系统激活单核巨噬细胞、内皮细胞、上皮细胞等，合成或释放出多种细胞因子和炎症介质，从而引起机体一系列的反应，如发烧、腹泻、休克、败血症、多器官衰竭甚至死亡。当菌体溶解或被杀灭死亡后，脂多糖被大量释放到周围环境中，因此它广泛存在于日常生活种的饮用水、食品、药品及生物制品中，严重危害了产品质量和人民的健康安全。目前，传统的内毒素检测方法主要有家兔热源检查法、鲎试剂法(LAL法)等，但是该类方法主要是基于酶催化反应的，因此在实际样品检测中容易受到蛋白酶等酶的影响而导致结果不准确，同时检测耗时长，灵敏度低，不能满足快速灵敏的市场需求。另外，由于细菌死亡溶解导致LPS的释放，其污染难以避免，尤其是生物制品和最终产品中。因此发展快速、高效、灵敏的脂多糖检测方法具有重要的意义。近年来，一些基于特异性识别LPS分子的生物传感器如蛋白生物传感器(LBP结合蛋白、CD14、rFC)、多肽生物传感器(PmB)、抗体生物传感器等在脂多糖检测方面得到了初步应用。这些检测方法虽然提高了检测的灵敏度，但是这些蛋白分子特异性不强，容易与其他分子结合，从而影响了检测结果的准确性；多肽的设计和制备成本高，同时检测过程较复杂；而抗体制备需要进行动物实验，同样存在时间长、成本高的缺点。核酸适配体是利用上世纪90年代初发展的一种新的组合化学技术——SELEX(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment，指数富集的配体系统进化技术)技术通过孵育、分离、扩增等反复多轮筛选得到的一段具有特定复杂三维结构并能特异性结合靶标分子的单链DNA或RNA序列。作为一种新型的仿生识别分子，核酸适配体能选择性地特异结合靶标分子。由于其具有靶分子范围广、可体外化学合成、稳定性好、制备及修饰方便、成本低等优点，近年来在疾病治疗、医疗诊断、环境检测和食品安全等方面的应用引起了广泛的关注。经过近30年的发展，已开发了各种各样的SELEX技术，如CE-SELEX、Magnetic-CELEX、GO-SELEX、PD-SELEX、Capture-SELEX、Cell-SELEX等，尽管利用这些SELEX技术筛选得到诸如有机染料、金属离子、氨基酸、抗生素、蛋白质、细胞、致病菌等近600种核酸适配体，但是除了哌加他尼钠(pegaptanibsodium)和凝血酶核酸适配体外，能实际应用和开发的核酸适配体并不多。这可能是与筛选过程的不确定性有一定的关系。目前大部分筛选技术都是建立在固定靶标的基础上发展起来的，由于靶标的固定需要进行化学修饰从而改变了目标物质的天然结构，因此筛选到的适配体特异性不强、亲和性不高，实际应用受限。而毛细管电泳-SELEX技术等(CE-SELEX)虽然使靶标和文库均游离状态，保持了靶标的天然结构，但是该方法仅适用于大分子的筛选，另外，大分子可能存在多个结合位点，因此难以筛选到特定结合位点的核酸适配体。Capture-SELEX技术是通过非共价平衡作用将寡核苷酸文库固定到磁珠、琼脂糖颗粒等基质上而发展的一种文库固定、靶标游离的SELEX技术，虽然具有免标记、免固定的优点，弥补了CE-SELEX不能筛选小分子的不足，但是同样存在着筛选的不确定性。因此，开发定向SELEX筛选技术具有广阔的应用前景。本专利技术以鼠伤寒沙门氏菌核酸适配体为唯一靶标，利用生物素-亲和素作用将随机寡核苷酸文库通过生物素化的短互补链固定在亲和素包被的Fe3O4磁性纳米颗粒上，经过孵育、分离、扩增、酶切制备单链、克隆测序等步骤进行筛选，当文库富集到一定程度后，再加入沙门氏菌和大肠杆菌完整的活性菌作为定向分子进行定向筛选出特异性和广谱性均较高的细菌脂多糖核酸适配体。这种筛选策略利用脂多糖的结构特点和Capture-SELEX技术的优势，无需使用多靶标混筛选，就能筛选到能识别鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、大肠杆菌及铜绿假单胞菌等不同细菌来源的脂多糖核酸适配体，具有操作简便、效果明显、筛选成本低的优势。所获得的适配体具有稳定性高、合成方便、易标记功能基团和报告分子，能应用于饮用水、食品或临床医学等方面脂多糖的分析检测、分离富集和毒性中和。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种细菌脂多糖广谱性寡核苷酸适配体的定向筛选方法，它操作简单、效果明显。本专利技术的另一目的在于提供一条识别细菌脂多糖的广谱性寡核苷酸适配体，为开发细菌脂多糖的新型分离富集或分析检测技术奠定良好基础。本专利技术方法基于靶标游离、文库固定的Capture-SELEX筛选技术，利用生物素-亲和素作用将随机寡核苷酸文库通过生物素化的短互补链固定在亲和素包被的Fe3O4磁性纳米颗粒上，经过孵育、分离、扩增、酶切制备单链、克隆测序等步骤反复筛选，当与脂多糖亲和性的文库富集到一定程度后，再加入沙门氏菌和大肠杆菌完整的活性菌作为定向筛选分子进行定向筛选，经过共15轮的反复筛选最终获得一条能识别四种脂多糖的广谱性核酸适配体。本专利技术的优点：(1)与传统的筛选技术相比，该定向策略操作简单、效果显著，同时无需使用多靶标混筛选，不仅降低了成本，还提高了筛选成功率；(2)适配体可在体外筛选，筛选周期短，稳定性高、合成方便、易标记功能基团和报告分子，可长期保存使用；(3)所获得的核酸适配体能同时识别鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、大肠杆菌及铜绿假单胞菌等4种细菌来源的脂多糖，具有较好的广谱性和特异性。附图说明图1是LPS广谱核酸适配体的定向筛选流程图。图2是寡核苷酸适配体EA7的模拟二级结构图。图3是寡核苷酸适配体EA7的饱和结合曲线图。图4是寡核苷酸适配体EA7的特异性试验结果。具体实施方式：以下结合说明书附图和实施例对本专利技术作进一步的说明，但不是限制本专利技术。1、体外化学合成随机单链寡核苷酸(ssDNA)文库及引物(IDT公司合成)，具体序列如下：ssDNA文库：5′-ATAGGAGTCACGACGACCAG-(40nt)-TATGTGCGTCTACCTCTTGA-3′；(长度80bp,中间为40个碱基的随机序列，两端分别为20nt的固定序列，库容量在1014以上。)上游引物P1：5′-ATAGGAGT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一条能识别鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、大肠杆菌及铜绿假单胞菌等不同细菌来源的脂多糖核酸适配体，其特征在于寡核苷酸适配子序列如序列表中序列1所示的序列。

【技术特征摘要】
1.一条能识别鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、大肠杆菌及铜绿假单胞菌等不同细菌来源的脂多糖核酸适配体，其特征在于寡核苷酸适配子序列如序列表中序列1所示的序列。2.制备如权利要求1所述的能特异识别细菌脂多糖的广谱核酸适配体定向筛选方法，其特征在于基于免标记的Capture-SELEX技术筛选富集后，加入活菌作为定向筛选分子进行定向筛选。3.如权利要求1中所述的核酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：王周平，叶华，段诺，吴世嘉，夏雨，马小媛，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32