一种检测汞离子的比色生物传感器及其制备方法技术

本发明专利技术涉及生物传感器技术领域，特别涉及一种检测汞离子的比色生物传感器及其制备方法。由以下制备方法制备而成：合成金纳米粒子；将Probe4修饰到金纳米粒子表面；将标记的纳米金溶液与均相反应溶液混合。本发明专利技术利用了核酸适配体的特异型识别，利用“T‑Hg

Colorimetric biological sensor for detecting mercury ion and preparation method thereof

The invention relates to the technical field of biological sensors, in particular to a colorimetric biosensor for detecting mercury ions and a preparation method thereof. Prepared by the following preparation methods: synthesizing gold nanoparticles; modifying Probe4 onto the surface of gold nanoparticles; mixing labeled gold nanoparticles with homogeneous reaction solutions. The invention uses the specific recognition of the aptamer, using \T Hg

【技术实现步骤摘要】
一种检测汞离子的比色生物传感器及其制备方法
本专利技术涉及生物传感器
，特别涉及基于核酸适配体检测汞离子的生物传感器，还涉及其制备方法。
技术介绍
由于一些重金属离子的存在对水环境以及人类的健康有着不利的影响，对水生生态系统中的重金属离子的监测开始受到人们的广泛重视。汞离子是有毒重金属污染物，广泛存在于水，土壤甚至食物中。汞离子可以损伤大脑，心脏，胃，肠和肾脏。微量的汞可以通过食物链累积在人体内，造成慢性汞中毒。目前报道的汞离子的检测方法包括原子发射光谱法、原子吸收光谱法、电感耦合等离子体质量光谱法，电化学方法等，这些方法往往存在仪器昂贵、分析周期长、样品预处理复杂、检测费用昂贵等问题，对于汞离子检测的方便、快捷、灵敏度等方面的要求已难以适应。因此，目前急需建立一种快速，准确，灵敏且高特异性的检测方法来检测汞离子的残留。
技术实现思路
为了解决以上现有技术中检测汞离子的方法特异性和灵敏度都比较低、成本高、检测周期长的问题，本专利技术提供了一种特异性和灵敏度高、成本低、检测速度快的基于链置换以及纳米金检测汞离子的比色生物传感器。同时，还涉及其制备方法。本专利技术是通过以下步骤得到的：本专利技术中一共用到了4条DNA链，其序列分别是：Probe1：5’-GGTCACGCTTTCTTCTTTCTTTC-3’（SEQIDNO:1）；Probe2：5’-GAAAGCGTGACACAG-3’(SEQIDNO:2）；Probe3：5’-GTTTGTTTGTTGTTAGCGTGACGGTC-3’(SEQIDNO:3）；Probe4：5’-SH-TTTCACGCTTTC-3’(SEQIDNO:4）。其中Probe1的斜体部分是Probe2斜体部分的互补序列，在汞离子存在的情况下，Probe3的横线部分会与Probe1的横线部分形成“T-Hg2+-T”结构，接着引发Probe3的斜体部分与Probe1斜体部分进行碱基互补配对，释放Probe2，完成链置换过程。同时核酸外切酶Ⅲ水解双链，释放Probe3继续重复上述过程，实现信号放大。Probe4的5’端修饰-SH，通过Au-S共价键将Probe4修饰到纳米金表面，由于Probe4的斜体部分与Probe2的斜体部分进行碱基互补配对，在酶的作用下水解Probe4，释放Probe2，将金纳米粒子间的距离拉近，使得金纳米粒子聚沉。释放的Probe2又可继续同Probe4杂交实现第二步循环信号放大。通过测量纳米金溶液的吸光度来定量检测汞离子。本专利技术中汞离子的检测是在均相溶液中实现的，通过链置换的方式来实现信号的放大，从而实现汞离子的高灵敏检测，并获得较低的检测下限。均相中发生的反应主要有：Probe1与Probe2进行碱基互补配对。当有汞离子存在时，由于Probe1与Probe3中的碱基T与目标物之间形成“T-Hg2+-T”的特异性复合结构，引发两条DNA链的剩余部分也开始进行碱基互补配对，从而置换出Probe2，同时核酸外切酶Ⅲ水解双链，释放Probe3继续重复上述过程，实现信号放大。在均相反应中，反应条件为37℃，反应时间是30min。所述的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：（1）进行纳米金粒子的制备；（2）将Probe4（含-SH）修饰到纳米金粒子表面；（3）将标记的纳米金溶液与均相反应溶液混合。所述的制备方法，优选纳米金粒子的制备操作步骤如下：①安装好所需仪器，向三口烧瓶中加入200ml超纯水（注意不要让三口烧瓶中落入灰尘）；②取500uL（0.04g/ml）HAuCl4于单个包装的离心管中，用移液枪取500ul于200ml超纯水中，搅拌加热，搅拌速度450转左右，至煮沸；③在搅拌的条件下，取3ml1%的柠檬酸三钠溶液快速加入溶液中，几分钟内，溶液颜色由浅黄色变为酒红色，继续加热15min后，撤去热源，慢慢冷却至室温，至于4℃保存备用。④取60ul金纳米颗粒溶液于微量比色皿中，使用UV-2600紫外可见分光光度计对其进行光吸收波谱扫描，根据波长在530nm处的摩尔消光系数3.0×109M-1cm-1计算出金纳米颗粒溶液的浓度约为0.3nM。所述的制备方法，优选将Probe4（含-SH）修饰到金纳米粒子表面的具体操作步骤如下：①取1mL纳米金溶液于离心管中，离心10min，同时离心两管备用。离心至上清液无色透明，去除上清液，加入300μL灭菌水使纳米金溶液浓缩至3nM。移入1mL玻璃瓶中，用锡箔纸封口。②室温放置30min后，加入150μL浓度为30μM的修饰了-SH的底物探针（Probe4），混合均匀后，4℃下放置24h。③分多次缓慢加入50μLPB缓冲液，加入磁子（前一天用王水浸泡）搅拌10min后，继续加入27μLPBS缓冲液。取出磁子，4℃放置48h。④将标记好的纳米金溶液转移至离心管中，加入灭菌水至1mL，离心10min，去除上清液。再加入1mL灭菌水离心，此过程重复两次（为了洗脱未标记上的DNA链）。该专利技术的检测方式是纳米金比色检测，利用水解DNA链将金纳米粒子间距离拉近，使其产生聚沉，从而产生颜色的变化。在检测之前，先通过Au-S键将Probe4修饰到金纳米粒子表面。然后将反应后的均相溶液与标有Probe4的纳米金粒子混合，在37℃孵育1h完成酶的水解过程。最后，通过检测溶液的紫外吸收光谱进行目标物的检测。本专利技术基于核酸适配体与目标物的特异性识别，利用“T-Hg2+-T”的错配结构实现链置换等温放大特性构建了适体生物传感器。该传感器具有检测速度快，检测限低，灵敏度高等优点，可以弥补汞离子现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速，准确的定量检测。所述的制备方法，优选将标记的纳米金溶液与均相反应溶液混合，37℃水浴下反应1h。本专利技术的有益效果：1、利用了核酸适配体的特异型识别，利用“T-Hg2+-T”的特异性结合实现了对目标物汞离子的高特异性检测；2、利用链置换循环放大功能，实现了Probe2和Probe3的循环利用，放大了检测信号，提高了检测的灵敏度，实现对目标物汞离子的超灵敏性检测；3、该传感器的反应条件温和，反应速度快；4、由于使用纳米金比色法，其检测方法操作简便、检测周期短、易携带；5、检测原理的主要过程均是在均相中实现的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测；6、制备方法简单，性能稳定，纳米金比色的重复性好，适用于食品安全及水体中汞离子的检测和生物传感器产业化的实际应用；7、制作该生物传感器的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求。附图说明图1为该实验的原理图；图2为实施例1Probe1浓度优化检测结果图；图3为实施例2Probe2浓度优化检测结果图；图4为实施例3Probe3浓度优化检测结果图；图5为实施例4传感器检测的标准曲线。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步说明。所述的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：（1）进行纳米金粒子的制备；（2）将Probe4修饰到纳米金粒子表面；（3）将标记的纳米金溶液与均相反应溶液混合。所述的制备方法，优选纳米金粒子的制备操作步骤如下：①安装好所需仪器，向三口烧瓶中加入200ml超纯水（注意不要让三口烧瓶中落入灰尘）；②取500uL（0.04g/ml）HAuCl4于单个本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测汞离子的比色生物传感器 ，其特征在于，由以下步骤制备而成：（1）纳米金粒子的制备；（2）将Probe4修饰到纳米金粒子表面；（3）将标记的纳米金溶液与均相反应溶液混合；所述Probe4的碱基序列如SEQ ID NO：4所示。

【技术特征摘要】
1.一种检测汞离子的比色生物传感器，其特征在于，由以下步骤制备而成：（1）纳米金粒子的制备；（2）将Probe4修饰到纳米金粒子表面；（3）将标记的纳米金溶液与均相反应溶液混合；所述Probe4的碱基序列如SEQIDNO：4所示。2.根据权利要求1所述的比色生物传感器，其特征在于，纳米金粒子的制备步骤如下：(1)向三口烧瓶中加入200ml超纯水；(2)取500uL，0.04g/mlHAuCl4于单个包装的离心管中，用移液枪取500ul于三口烧瓶中，搅拌加热，搅拌速度450转左右，至煮沸；(3)在搅拌的条件下，取3ml1%的柠檬酸三钠溶液快速加入溶液中，几分钟内，溶液颜色由浅黄色变为酒红色，继续加热15min后，撤去热源，慢慢冷却至室温，置于4℃保存备用。3.根据权利要求1所述的比色生物传感器，其特征在于，将Probe4修饰到纳米金粒子表面的具体操作步骤如下：(1)取1mL纳米金溶液于离心管中，离心10min，同时离心两管备用；离心至上清液无色透明，去除上清液，加入300μL灭菌水使纳米金溶液浓缩至3nM；移入1mL玻璃瓶中，用锡箔纸封口；(2)室温放置30min后，加入150μL浓度...

【专利技术属性】
技术研发人员：李慧，韩聪，宋晓蕾，刘素，王玉，黄加栋，裴倩倩，冷雪琪，崔雪珺，张雪，王敬锋，王海旺，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东,37