汞离子食品污染中直接竞争酶联免疫检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种基于直接竞争酶联免疫法汞离子检测试剂盒，包括：包被有羊抗鼠IgG二抗的检测板，所述检测板真空密封包装；所述羊抗鼠IgG二抗的包被浓度为50～200μg/mL；质量浓度为20～50μg/mL的酶标Hg‑ITCBE鳌合物半抗原；质量浓度为10～20μg/mL的抗汞离子单克隆抗体溶液；所述抗汞离子单克隆抗体溶液由Hg‑ITCBE‑cBSA免疫原免疫Balb/C小鼠制备而来；1.0～3.0mol/L的终止液；样品稀释液；底物显色液；洗涤液；汞离子标准品溶液；质量浓度为10～20mg/mL的EDTA处理液。本发明专利技术提供试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点，同时具有检测时间短的优点。

Reagent kit for detecting mercury ion based on direct competition enzyme-linked immunosorbent assay and application thereof

The present invention provides a direct competitive enzyme-linked immunosorbent assay method based on mercury ion detection kit, including: coated with Goat anti mouse IgG two anti detection plate, the detecting plate vacuum sealed packaging; the Sheep anti mouse anti IgG two package is a concentration of 50 to 200 mu g/mL; concentration 20 ~ 50 g /mL Hg ITCBE ELISA chelate hapten; the concentration of 10 ~ 20 g/mL anti mercury ion monoclonal antibody solution; the anti mercury ion solution by Hg monoclonal antibody ITCBE cBSA immunized Balb/C mice were prepared; 1 ~ 3.0mol/L stop solution sample dilution;; chromogenic substrate liquid; washing liquid; mercury ion standard solution; mass concentration is 10 ~ 20mg/mL EDTA solution. The kit provided by the invention has the advantages of high sensitivity and strong specificity, and has the advantages of short detection time simultaneously.

【技术实现步骤摘要】
一种基于直接竞争酶联免疫法检测汞离子试剂盒及其应用
本专利技术属于环境检测
，具体涉及一种基于直接竞争酶联免疫法检测汞离子试剂盒及其制备方法和应用。
技术介绍
汞，俗称水银，是在常温、常压下唯一以液态存在的金属。近现代社会的快速发展，汞越来越被广泛应用于农业、工业、制药业、冶金及牙科上，汞蒸汽和汞的化合物多有剧毒。伴随着在各领域的应用，汞形成了大气、水体和土壤的立体污染循环，并通过植物、鱼类体内富集，再经过食物链进入人体，在肝、肾、脑等组织中再富集，抑制人体酶活性，扰乱正常新陈代谢，甚至造成畸形，严重威胁到人类健康和食品安全。由于Hg2+具有高度亲电子性，所以对体内的最重要的巯基、羰基、羧基、羟基等活性基团均具有很强的攻击力，从而使这些活性基团失去活性，对机体生理生化功能产生巨大影响。此外，有机汞中的甲基汞最容易透过胎盘，从母体转移给胎儿，而胎儿对甲基汞具有很高的蓄积能力，由于胎盘转移致使胎儿产生严重的胎儿性甲基汞中毒事例已经有多起报道。慢性汞中毒主要症状表现为精神异常、齿龈炎、震颤和肾炎等；急性汞中毒主要表现为急性腐蚀性口腔炎和胃肠炎，严重时可发生急性肾功能衰竭、肝脏损害。皮肤接触汞及其化合物可引起接触性皮炎，具有变态反应性质。由于汞的污染和危害较大，我国制定了土壤、食品、水体、化妆品等涉汞领域中的国家限量标准，食品中牛乳汞允许量标准(GB2762-94)为≤0.01mg/Kg，地下水质量标准(GB7468-2012)中规定，主要适用于集中式生活用水水源及农田灌溉水的汞离子限量标准为≤0.01mg/L。目前动物性食品及环境水样中Hg2+污染的主要检测方法包括传统的理化检验和免疫学检验两种类型的方法。理化检验包括紫外分光光度法(UV)、电化学分析法、原子吸收光谱法(AAS)、电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)、电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)、氢化物发生-原子荧光光谱法(HG-AFS)和中子活化分析法(NAA)等，它们是目前Hg2+污染检测的主要方法，灵敏度高，结果准确，但由于需要昂贵的仪器设备、熟练的专业人员、烦琐费时、周期长、费用高、不能现场操作、样品筛检量小等缺陷，其应用受到了限制。免疫学检验方法是以抗原抗体分子的特异性、可逆性反应为基础的分析技术，包括荧光偏振免疫测定法(FPIA)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、KinExA免疫测定法(KIA)、胶体金免疫层析试验测定法(GICA)和微悬臂梁免疫传感器(MIS)等，由于抗原抗体的结合具有高度的选择性和敏感性，这一技术具有简便、快速、敏感、特异、经济、筛检量大等优势，代表着重金属离子检测的发展方向。目前，国内外重金属汞离子污染免疫检测技术研究非常活跃，其中公告号为CN103472231B的专利公开了一种汞离子间接竞争ELISA试剂盒，检测灵敏度为10.31ng/mL，并且检测时间较长。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种基于直接竞争酶联免疫法检测汞离子试剂盒及其应用，使所述试剂盒具有检测时间短的优点，同时具有灵敏度高、特异性强的特点。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种基于直接竞争酶联免疫法汞离子检测试剂盒，包括：(1)包被有羊抗鼠IgG二抗的检测板，所述检测板真空密封包装；所述羊抗鼠IgG二抗的包被浓度为50～200μg/mL；(2)质量浓度为20～50μg/mL的酶标Hg-ITCBE鳌合物半抗原溶液；(3)质量浓度为10～20μg/mL的抗汞离子单克隆抗体溶液；所述抗汞离子单克隆抗体溶液由Hg-ITCBE-cBSA免疫原免疫Balb/C小鼠制备而来；(4)1.0～3.0mol/L的终止液；(5)样品稀释液；(6)底物显色液；(7)洗涤液；(8)汞离子标准品溶液；(9)质量浓度为10～20mg/mL的EDTA处理液。优选的，所述羊抗鼠IgG二抗的包被浓度为80～150μg/mL。优选的，所述酶标Hg-ITCBE鳌合物半抗原的质量浓度为30～40μg/mL。优选的，所述抗汞离子单克隆抗体溶液的质量浓度为13～18μg/mL。优选的，所述样品稀释液为质量浓度为2～10g/L的HEPES缓冲液。优选的，所述洗涤液为包含质量浓度0.05～0.1％Tween20的PBS溶液。本专利技术还提供了所述汞离子检测试剂盒在检测环境中汞离子的应用，包括以下步骤：a、将抗汞离子单克隆抗体溶液、稀释的待测样品溶液和酶标Hg-ITCBE鳌合物半抗原溶液，加入到包被有羊抗鼠IgG二抗的检测板孔内，混合，孵育后用洗涤液洗涤；b、向检测板中加入底物显色液，孵育，加入终止液混合，测定OD值；c、根据所述步骤b得到的OD值与预定的标准曲线，得到待测样品中汞离子的浓度，所述标准曲线是汞离子浓度与OD值之间的线性关系曲线。优选的，所述检测板孔内抗汞离子单克隆抗体溶液、稀释的待测样品溶液和酶标Hg-ITCBE鳌合物半抗原溶液的体积比为1～2：1～2：1～2。优选的，所述步骤a和b中孵育的温度独立地为30～40℃。优选的，所述步骤a和b中孵育的时间独立地为5～30min。本专利技术提供了一种基于直接竞争酶联免疫法汞离子检测试剂盒，包括：(1)包被有羊抗鼠IgG二抗的检测板，所述检测板真空密封包装；所述羊抗鼠IgG二抗的包被浓度为50～200μg/mL；(2)质量浓度为20～50μg/mL的酶标Hg-ITCBE鳌合物半抗原；(3)质量浓度为10～20μg/mL的抗汞离子单克隆抗体溶液；所述抗汞离子单克隆抗体溶液由Hg-ITCBE-cBSA免疫原免疫Balb/C小鼠制备而来；(4)1.0～3.0mol/L的终止液；(5)样品稀释液；(6)底物显色液；(7)洗涤液；(8)汞离子标准品溶液；(9)质量浓度为10～20mg/mL的EDTA处理液。本专利技术根据抗原抗体直接竞争性免疫层析原理设计，通过在检测板上预包被羊抗鼠IgG二抗，使抗汞离子单克隆抗体、待检样品或汞离子标准品溶液和酶标半抗原(Hg-ITCBE-HRP)三种物质能够同时加入，抗汞离子单克隆抗体与预包被羊抗鼠IgG二抗结合形成复合物，样品或标准品中的汞离子和酶标半抗原竞争性地与抗汞离子单克隆抗体溶液结合，当加入底物显色液时，样品吸光度值与其残留的汞离子含量呈负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中汞离子的含量。本专利技术提供的试剂盒，减少了传统竞争法中两次孵育和洗涤次数，缩短了孵育和洗涤的时间30min，使试剂盒快速简便地得到检测结果，大大缩短了检测周期。本专利技术提供的汞离子检测试剂盒最低检测限(LOD)可达0.12μg/L，检测范围为0.23～46μg/L。附图说明图1为实施例1中免疫原合成路线图；图2为实施例8中建立的dELISA和ciELISA标准曲线。具体实施方式本专利技术提供了一种基于直接竞争酶联免疫法汞离子检测试剂盒，包括：(1)包被有羊抗鼠IgG二抗的检测板，所述检测板真空密封包装；所述羊抗鼠IgG二抗的包被浓度为50～200μg/mL；(2)质量浓度为20～50μg/mL的酶标Hg-ITCBE鳌合物半抗原溶液；(3)质量浓度为10～20μg/mL的抗汞离子单克隆抗体溶液；所述抗汞离子单克隆抗体溶液由Hg-ITCBE-cBSA免疫原免疫Balb/C本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于直接竞争酶联免疫法汞离子检测试剂盒，包括：(1)包被有羊抗鼠IgG二抗的检测板，所述检测板真空密封包装；所述羊抗鼠IgG二抗的包被浓度为50～200μg/mL；(2)质量浓度为20～50μg/mL的酶标Hg‑ITCBE鳌合物半抗原溶液；(3)质量浓度为10～20μg/mL的抗汞离子单克隆抗体溶液；所述抗汞离子单克隆抗体溶液由Hg‑ITCBE‑cBSA免疫原免疫Balb/C小鼠制备而来；(4)1.0～3.0mol/L的终止液；(5)样品稀释液；(6)底物显色液；(7)洗涤液；(8)汞离子标准品溶液；(9)质量浓度为10～20mg/mL的EDTA处理液。

【技术特征摘要】
1.一种基于直接竞争酶联免疫法汞离子检测试剂盒，包括：(1)包被有羊抗鼠IgG二抗的检测板，所述检测板真空密封包装；所述羊抗鼠IgG二抗的包被浓度为50～200μg/mL；(2)质量浓度为20～50μg/mL的酶标Hg-ITCBE鳌合物半抗原溶液；(3)质量浓度为10～20μg/mL的抗汞离子单克隆抗体溶液；所述抗汞离子单克隆抗体溶液由Hg-ITCBE-cBSA免疫原免疫Balb/C小鼠制备而来；(4)1.0～3.0mol/L的终止液；(5)样品稀释液；(6)底物显色液；(7)洗涤液；(8)汞离子标准品溶液；(9)质量浓度为10～20mg/mL的EDTA处理液。2.根据权利要求1所述的检测汞离子试剂盒，其特征在于，所述羊抗鼠IgG二抗的包被浓度为80～150μg/mL。3.根据权利要求1所述的检测汞离子试剂盒，其特征在于，所述酶标Hg-ITCBE鳌合物半抗原溶液的质量浓度为30～40μg/mL。4.根据权利要求1所述的检测汞离子试剂盒，其特征在于，所述抗汞离子单克隆抗体溶液的质量浓度为13～18μg/mL。5.根据权利要求1所述的检测汞离子试剂盒，其特征在于，所述样...

【专利技术属性】
技术研发人员：王秋霞，马景周，欧长波，张艳红，魏小兵，余燕，刘兴友，姜金庆，秦保亮，
申请(专利权)人：河南科技学院，方城县机电信息中等职业学校，
类型：发明
国别省市：河南,41