血清复合靶核酸适配体筛选方法技术

血清复合靶核酸适配体筛选方法。本筛选方法包括四步，本筛选方法包括四步，第一步将待筛选的血清复合靶与琼脂磁珠偶联，形成琼脂磁珠‑血清复合物，37℃孵育6小时；第二步将随机寡核苷酸文库进行加热变性处理，与琼脂磁珠‑血清复合物相结合，用缓冲液冲洗掉未结合和结合力弱的靶标分子ssDNA，获得与血清复合物结合的核酸适配体分子；第三步对血清复合物的核酸适配体分子通过q‑PCR扩增，再用PCR扩增产物制备得到次级ssDNA库，通过q‑PCR动态检测与血清复合物结合的核酸适配体；第四步重复第二步所述的，筛选得到高特异性、强亲和力的血清复合物核酸适配体。本发明专利技术用于血清复合靶核酸适配体筛选。

Screening method for serum composite target nucleic acid aptamer

Screening method for serum composite target nucleic acid aptamer. This method includes four steps, the screening method includes four steps, the first step will be screening serum composite target and agar agar agar beads beads coupled serum complexes, 37 C were incubated for 6 hours; the second step will be the random oligonucleotide library heating denaturation treatment combined with agar beads serum complexes. With the buffer flush off the target molecule and the binding force of ssDNA with weak, nucleic acid combined with serum complexes of aptamer; third step nucleic acid on serum complexes of aptamer Q by PCR amplification, then PCR amplification products were prepared by secondary ssDNA library aptamer binding by Q PCR dynamic detection and serum complexes; fourth steps repeat the second step wherein the serum compound nucleic acid screening of high specificity, high affinity aptamers. The present invention is used for aptamer screening of serum composite target.

【技术实现步骤摘要】
血清复合靶核酸适配体筛选方法
：本专利技术涉及一种血清复合靶核酸适配体筛选方法。
技术介绍
：核酸适配体是由一段DNA或RNA组成的能与各类靶标分子结合的化学抗体。可应用于食品检测、环境污染检测和肿瘤诊断及治疗等领域。由于适配体是体外人工快速合成的，可PCR扩增，对热不敏感，可重复利用，克服了抗体受免疫系统限制，生产周期长，稳定性差，储存条件苛刻等缺陷。已经报道的快速筛选方法有毛细管电泳的筛选方法，这类方法库容量小，需要多次筛选，另一类是细胞筛选的方法，筛选效率低，周期长。
技术实现思路
：本专利技术的目的是提供一种解决了从异常血清中筛选得到与正常人血清有差异蛋白的核酸适配体，简化了筛选步骤，缩短了筛选周期，整个筛选进程由q-PCR检测的血清复合靶核酸适配体筛选方法。上述的目的通过以下的技术方案实现：一种血清复合靶核酸适配体筛选方法，本筛选方法包括四步，第一步将待筛选的血清复合靶与琼脂磁珠偶联，形成琼脂磁珠-血清复合物，37℃孵育6小时；第二步将随机寡核苷酸文库进行加热变性处理，与琼脂磁珠-血清复合物相结合，用缓冲液冲洗掉未结合和结合力弱的靶标分子ssDNA，获得与血清复合物结合的核酸适配体分子；第三步对血清复合物的核酸适配体分子通过q-PCR扩增，再用PCR扩增产物制备得到次级ssDNA库，通过q-PCR动态检测与血清复合物结合的核酸适配体；第四步重复第二步所述的，筛选得到高特异性、强亲和力的血清复合物核酸适配体。所述的血清复合靶核酸适配体筛选方法，所述的第二步随机寡核苷酸文库是将5nmol随机寡核苷酸溶于4mL结合缓冲液中，所述的结合缓冲液是磷酸缓冲液和5mol／LMgCl2组成的溶液。所述的血清复合靶核酸适配体筛选方法，磷酸缓冲液和5mol／LMgCl2比例为20：1。所述的血清复合靶核酸适配体筛选方法，所述的第二步的靶标分子ssDNA是与琼脂磁珠-血清复合物结合的ssDNA。所述的血清复合靶核酸适配体筛选方法，所述的第三步制备次级ssDNA库包括如下步骤：将q-PCR扩增后的产物与链霉亲和素磁珠37℃孵育6小时，用1%tween+磷酸缓冲液在80℃水浴3次，然后加入2ml结合缓冲液，变性并收集上清液，4℃保存，即制备得到次级ssDNA库。有益效果：1.本专利技术的血清复合靶核酸适配体筛选是从异常血清中筛选得到与正常人血清差异蛋白的核酸适配体，利用q-PCR动态检测筛选进程，操作简单，便于快速筛选得到血清复合靶核酸适配体。2.本专利技术的筛选复合靶核酸适配体简单、快速，成本低，易于实现自动化。3.本专利技术的筛选方法是从异常血清复合物中筛选差异蛋白核酸适配体，而毛细管电泳筛选方法是毛细管电泳只能筛选单一靶标的核酸适配体，与细胞筛选适配体相比，筛选出的核酸适配体可以组装成相应疾病的筛查试剂盒，本筛选方法易于实现自动化。4.本专利技术中如果加入充足的琼脂磁珠，就能够充分结合血清中的蛋白，且收集和洗脱过程简单，易于自动化。5.本专利技术的筛选方法流程简单、快速，不需要昂贵的耗材，降低了成本。6.本专利技术的筛选方法所筛选的适配体可用于获取特异性蛋白。7.本专利技术的筛选方法所筛选到的适配体可用于靶向药物的构建。具体实施方式：下面将结合本专利技术，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例1：一种血清复合靶核酸适配体筛选方法，本筛选方法包括四步，第一步将待筛选的血清复合靶与琼脂磁珠偶联，形成琼脂磁珠-血清复合物，37℃孵育6小时；第二步将随机寡核苷酸文库进行加热变性处理，与琼脂磁珠-血清复合物相结合，用缓冲液冲洗掉未结合和结合力弱的靶标分子ssDNA，获得与血清复合物结合的核酸适配体分子；第三步对血清复合物的核酸适配体分子通过q-PCR扩增，再用PCR扩增产物制备得到次级ssDNA库，通过q-PCR动态检测与血清复合物结合的核酸适配体；第四步重复第二步所述的，筛选得到高特异性、强亲和力的血清复合物核酸适配体。实施例2：实施例1所述的血清复合靶核酸适配体筛选方法，所述的第二步随机寡核苷酸文库是将5nmol随机寡核苷酸溶于4mL结合缓冲液中，所述的结合缓冲液是磷酸缓冲液和5mol／LMgCl2（氯化镁）组成的溶液。实施例3：实施例2所述的血清复合靶核酸适配体筛选方法，磷酸缓冲液和5mol／LMgCl2（氯化镁）比例为20：1。实施例4：实施例1所述的血清复合靶核酸适配体筛选方法，所述的第二步的靶标分子ssDNA是与琼脂磁珠-血清复合物结合的ssDNA。实施例5：实施例1所述的血清复合靶核酸适配体筛选方法，所述的第三步制备次级ssDNA库包括如下步骤：将q-PCR扩增后的产物与链霉亲和素磁珠37℃孵育6小时，用1%tween（吐温）+磷酸缓冲液在80℃水浴3次，然后加入2ml结合缓冲液，变性并收集上清液，4℃保存，即制备得到次级ssDNA库。实施例6：上述实施例所述的血清复合靶核酸适配体筛选方法，将待筛选的血清复合靶偶联在琼脂磁珠上，再将随机寡核苷酸文库与琼脂磁珠-血清复合物结合，然后用缓冲液冲洗掉与血清复合靶不结合的和结合弱的靶标分子ssDNA，得到与血清复合靶特异性结合的核酸适配体。对特异性结合的核酸适配体经过q-PCR扩增，通过链霉亲和素磁珠法制备得到次级ssDNA库。通过5-15轮筛选获得高特异性、强亲和力的血清复合靶核酸适配体。实施例7：上述实施例所述的血清复合靶核酸适配体筛选方法，（1）形成琼脂磁珠-异常血清复合物将1mL患者血清与数毫升琼脂磁珠结合，37℃孵育6小时；用磷酸缓冲液冲洗未结合的蛋白；（2）琼脂磁珠-异常血清复合物与ssDNA库结合将随机寡核苷酸文库进行加热变性处理，与琼脂磁珠-血清复合物相结合，用缓冲液冲洗掉未结合和结合力弱的ssDNA分子，获得与异常血清复合物结合的核酸适配体分子；（3）制备次级ssDNA库将q-PCR扩增后的产物与链霉亲和素磁珠37℃孵育数小时，用1%tween（吐温）+磷酸缓冲液在80℃水浴3次，然后加入2ml结合缓冲液，变性并收集上清液，4℃保存，即制备得到次级ssDNA库。血清复合靶核酸适配体筛选方法所筛选到的适配体用于靶向药物的构建和制备。ssDNA是single-strandedDNA的缩写，含义为：单链DNA。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种血清复合靶核酸适配体筛选方法，其特征是: 本筛选方法包括四步，第一步将待筛选的血清复合靶与琼脂磁珠偶联，形成琼脂磁珠‑血清复合物，37 ℃孵育6小时；第二步将随机寡核苷酸文库进行加热变性处理，与琼脂磁珠‑血清复合物相结合，用缓冲液冲洗掉未结合和结合力弱的靶标分子ssDNA，获得与血清复合物结合的核酸适配体分子；第三步对血清复合物的核酸适配体分子通过q‑PCR扩增，再用PCR扩增产物制备得到次级ssDNA库，通过q‑PCR动态检测与血清复合物结合的核酸适配体；第四步重复第二步所述的，筛选得到高特异性、强亲和力的血清复合物核酸适配体。

【技术特征摘要】
1.一种血清复合靶核酸适配体筛选方法，其特征是:本筛选方法包括四步，第一步将待筛选的血清复合靶与琼脂磁珠偶联，形成琼脂磁珠-血清复合物，37℃孵育6小时；第二步将随机寡核苷酸文库进行加热变性处理，与琼脂磁珠-血清复合物相结合，用缓冲液冲洗掉未结合和结合力弱的靶标分子ssDNA，获得与血清复合物结合的核酸适配体分子；第三步对血清复合物的核酸适配体分子通过q-PCR扩增，再用PCR扩增产物制备得到次级ssDNA库，通过q-PCR动态检测与血清复合物结合的核酸适配体；第四步重复第二步所述的，筛选得到高特异性、强亲和力的血清复合物核酸适配体。2.根据权利要求1所述的血清复合靶核酸适配体筛选方法，其特征是:所述的第二步随机寡核苷酸文库是将5nmol...

【专利技术属性】
技术研发人员：栗坤，李健，石明，
申请(专利权)人：秦皇岛拜恩发生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：河北,13