本发明专利技术涉及一种使用被设计成解决传统等位基因特异性PCR的问题的等位基因特异的反应性引物(ASRP)来扩增核酸的方法，更具体地，本发明专利技术涉及靶核酸的检测方法，包括具有校对活性的DNA聚合酶和与靶核酸互补的碱基序列，其中在ASRP存在下扩增靶核酸，所述ASRP被修饰为使得位于来自与引物5’方向上不互补的核苷酸紧邻的核苷酸到位于引物5'端的核苷酸的区域中的一个或多个修饰核苷酸，在3'端存在不互补的核苷酸时，该不互补的核苷酸将被DNA聚合酶的校对活性除去，以使等位基因特异的反应性引物中的核苷酸不能作为聚合酶反应的引物。根据本发明专利技术的使用ASRP的检测方法由于ASRP和校对DNA聚合酶的特性而成为具有非常高特异性的技术，并且能够有效地检测包括单核苷酸多态性(SNP)在内的突变(点突变、插入、缺失)。此外，该方法也可以用于检测亚硫酸氢盐处理后的CpG甲基化的存在，或者扩增并检测DNA文库中从所需核苷酸序列开始的靶DNA。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种使用被设计成解决传统等位基因特异性PCR的问题的等位基因 特异的反应性引物（ASRP)来扩增核酸的方法，更具体地，涉及用于检测靶核酸的方法，该 方法包括在具有校对活性的DNA聚合酶和等位基因特异的反应性引物（ASRP)存在下扩增 靶核酸，所述ASRP包括：i)与靶核酸互补的核苷酸序列，和ii) 一个或多个修饰核苷酸，位 于来自与引物5'方向上不互补的核苷酸紧邻的核苷酸到位于引物5'端的核苷酸的区域 中，在3'端存在不互补的核苷酸时，该不互补的核苷酸将被DNA聚合酶的校对活性除去，以 使等位基因特异的反应性引物中的核苷酸不能作为聚合酶反应的引物。
技术介绍
单核苷酸多态性（SNP)是当一个单核苷酸被其它三种核苷酸之一替换时发生的 DNA序列的遗传变异。它导致个体间的差异，如致病原因或对治疗药物的反应。单核苷酸多 态性的检测和鉴定不仅与个性化的药物相关联，也与新药开发相关联，因此已经受到了大 量的关注。 对于单核苷酸多态性的快速检测，已使用基于实时PCR技术的各种检测方法。这 些检测方法的典型实例包括使用DNA嵌入荧光染料的测定法，使用DNA探针的测定法和 使用PNA探针的测定法。然而，这些方法的缺点在于使用DNA嵌入荧光染料是受限的并 且需要使用用于分析恪解曲线的程序（KirkM.Ririeetal·，AnalyticalBiochemistry 245:154, 1997 ;U.Hladniketal·，ClinExpMed, 2:105,2002)。 具有3' 一 5'校对活性的DNA聚合酶确保了DNA复制的高保真性（Drake，J. ff.et.al.,ColdSpringHarb.Symp.Quant.Biol. , 33:339, 1968 ；Drake,J.ff.et. al.，Nature, 221:1128, 1968 ;Goodman,M.F.et.al. ·Genetics, 148:1475, 1998)，并且已经 发现了很多具有3'核酸外切酶活性的校对聚合酶。 具有fe对活性的DNA聚合酶确保了体内DNA复制的尚保真性，但是，当将具有 校对活性的DNA聚合酶应用到利用常规等位基因特异性的引物所进行的聚合酶链式 反应时，存在这样的问题，即，因为在3'端不匹配的碱基被除去，所以无论引物与用作 模板的DNA是完全杂交或是不完全杂交，引物的末端都会延伸（Zhang,J.etal.，Mol. Biotechnol. , 24:105, 2003) 〇 由于这个问题，在研究突变检测中几乎不使用具有校对活性的DNA聚合酶。然而 近几年，已经出现了针对于使用修饰引物的3'端的方法来检测靶核酸中的突变的方法的研 究，例如标记引物的3'端或将3'核酸外切酶抗性因子缀合至3'端的方法，或除去核苷酸 的3'端的-0H基团或用其他残基置换该-0H基团的方法（Zhang,J.etal.，CurrentDrug Disc. , 9:21, 2001 ；Bi,ff.L.andSambrook,P.J. ,NucleicAcidsRes. , 26:3073, 1998) 〇例如，在引物的3'端被标记的情况下，当引物互补结合到模板DNA时，产生扩增终 产物，同时在3'端的标签被保持，但是当引物不匹配模板DNA时，在3'端的标签被具有校 对活性的DNA聚合酶在校对时去除，因此产生不含标签的扩增终产物，这表明可以基于标 记的存在或不存在来检测突变。基于这个原理，可以将具有以各种方式进行3'端修饰的等 位基因特异性引物，以及具有校对活性的DNA聚合酶，应用于包括实时PCR、多孔板和微阵 列技术的各种平台。因此，本专利技术人进行了广泛的努力，以使用3'端修饰的引物和具有校对活性的DNA聚合酶来检测靶核酸，并且结果发现，在具有校对活性的DNA聚合酶存在下，使用其中 核苷酸的3'端被修饰的等位基因特异的反应性引物（ASRP)，特异地扩增出靶核酸，从而完 成了本专利技术。
技术实现思路
技术问题 本专利技术的一个目的是提供一种使用等位基因特异的反应性引物（ASRP)来检测靶 核酸的方法，以及用于从DNA文库选择性地扩增靶核酸的方法，所述等位基因特异反应性 引物（ASRP)包括与靶核酸互补的核苷酸序列，以及一个或多个修饰核苷酸，位于来自与引 物5'方向的不互补的核苷酸紧邻的核苷酸到位于引物5'端的核苷酸的区域中，在3'端存 在不互补的核苷酸时，该不互补的核苷酸将被DNA聚合酶的校对活性除去，以使在等位基 因特异的反应性引物中的核苷酸不能充当聚合酶反应的引物。 技术方案 为了达到上述目的，本专利技术提供了一种用于检测靶核酸的方法，该方法包括在具 有校对活性的DNA聚合酶和等位基因特异的反应性引物（ASRP)存在下，扩增靶核酸，所述 等位基因特异反应性引物（ASRP)包括：i)与靶核酸互补的核苷酸序列，和ii) 一个或多个 修饰核苷酸，位于来自与引物5'方向的不互补的核苷酸紧邻的核苷酸到位于引物5'端的 核苷酸的区域中，在3'端存在不互补的核苷酸时，该不互补的核苷酸将被DNA聚合酶的校 对活性除去，以使在等位基因特异的反应性引物中的核苷酸不能充当聚合酶反应的引物。 本专利技术还提供从DNA文库扩增以特定核苷酸序列开始的靶核酸的方法，该方法包 括在具有校对活性的DNA聚合酶和等位基因特异的反应性引物（ASRP)存在下，从DNA文库 中扩增靶核酸，所述靶核酸包括在其5'端与DNA文库的接头序列互补的核苷酸序列，和在 3'端与靶核酸互补的核苷酸序列和修饰核苷酸，以便在等位基因特异的反应性引物中的核 苷酸不能作为聚合酶反应的引物。 本专利技术还提供了一种用于检测靶核酸的方法，该方法包括在下述物质存在下扩增 靶核酸：（i)等位基因特异的反应性引物（ASRP)，所述ASRP包括在其5'端包含与靶核酸不 互补的核苷酸序列的标签序列，修饰单核苷酸和与靶核酸互补的核苷酸序列，所述等位基 因特异的反应性引物（ASRP)在其3'端具有一个或多个使得在等位基因特异的反应性引物 中的核苷酸不能作为聚合酶反应引物的修饰核苷酸；（ii)标签序列和报告子模板，所述报 告子模板含有与靶核酸互补的核苷酸序列的一部分；和（iii)具有3' 一5'核酸外切酶活 性的DNA聚合酶。【附图说明】 图1是示出利用等位基因特异的反应性引物（ASRP)的检测系统的示意图。 图2示出使用通用引物和ASRP检测单核苷酸突变来进行PCR扩增实验的结果。 图3示出使用通用引物和ASRP检测甲基化来进行PCR扩增实验的结果。图4是示出使用等位基因特异的反应性引物（ASRP)从DNA文库扩增从所需核苷 酸序列开始的靶DNA的过程的示意图。 图5是示出使用等位基因特异的反应性引物（ASRP)和具有3' 一 5'核酸外切酶 活性且没有校对活性的DNA聚合酶的检测系统的示意图，该ASRP包括标签序列，修饰单核 苷酸和与靶核酸互补的靶特异性序列。【具体实施方式】 除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属领域的技 术人员的通常理解相同的含义。通常，本文中使用的命名法是众所周知且在本领域中常用 的。 在一个方面，本专利技术涉及一种检测靶核酸的方法，该方法包括在具有校对本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测靶核酸的方法，该方法包括在具有校对活性的DNA聚合酶和等位基因特异的反应性引物(ASRP)存在下，扩增靶核酸，该等位基因特异的反应性引物包括i)与靶核酸互补的核苷酸序列，和ii)一个或多个修饰核苷酸，位于来自与引物5’方向上不互补的核苷酸紧邻的核苷酸到位于引物5'端的核苷酸的区域中，在3'端存在不互补的核苷酸时，该不互补的核苷酸将被DNA聚合酶的校对活性除去，以使等位基因特异的反应性引物中的核苷酸不能作为聚合酶反应的引物。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：安城皖，吴泰祯，
申请(专利权)人：基因特力株式会社，
类型：发明
国别省市：韩国;KR
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