检测结直肠癌的方法技术

本发明专利技术涉及一种提供关于结直肠癌诊断的信息的方法、一种用于诊断结直肠癌的组合物以及包含所述组合物的试剂盒，并且更特别涉及：一种提供关于通过使用特异性扩增多个甲基化结直肠癌标记基因的引物诊断结直肠癌的信息的方法；一种用于诊断结直肠癌的组合物；以及一种包含所述组合物的试剂盒。一种包含所述组合物的试剂盒。一种包含所述组合物的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】检测结直肠癌的方法


[0001]本专利技术涉及一种提供关于诊断结直肠癌的信息的方法、一种用于诊断结直肠癌的组合物以及包括所述组合物的试剂盒，并且更特别涉及一种提供关于使用特异性扩增多个甲基化结直肠癌标记基因的引物诊断结直肠癌的信息的方法、一种用于诊断结直肠癌的组合物以及一种包括所述组合物的试剂盒。

技术介绍

[0002]在哺乳动物细胞的基因组DNA中，除了A、C、G和T之外，还存在第五种碱基，是5
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甲基胞嘧啶(5
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mC)，其中一个甲基附接至胞嘧啶环的第五个碳上。5
‑
mC始终仅附接至CG二核苷酸的C(5'
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mCG
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3')，并且该CG通常表示为CpG。CpG中的C大部分被其所附接的甲基甲基化。CpG的这种甲基化抑制了基因组中重复序列如Alu或转座子的表达，并且CpG是哺乳动物细胞中最常发生基因外变化的位点。该CpG的5
‑
mC通过脱氨基作用自然转化为T。因此，在哺乳动物基因组中CpG仅以1％的频率出现，远低于其正常频率(1/4x1/4＝6.25％)。
[0003]存在称为CpG位点(CpG岛)的区域，其中CpG非常密集。CpG位点长度为0.2
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3kb，并且是C、G碱基分布百分比大于50％且CpG分布百分比为3.75％以上的高度集中区域。约45,000个CpG位点出现在整个人基因组中，并且集中发现于调控基因表达的启动子区域。实际上，CpG位点出现在持家基因的启动子中，持家基因约占人基因的一半(Cross S.等人,Curr.Opin.Gene Develop.,5:309,1995)。已知异常的DNA甲基化主要发生在相应基因的5'调控区，从而降低相应基因的表达。
[0004]在另一方面，在正常人的体细胞中，这些持家基因启动子区域的CpG岛没有发生甲基化，而是X染色体上的印记基因和失活基因发生甲基化，从而阻止所述印记基因和失活基因在发育过程中的表达。
[0005]在癌变过程中，启动子CpG岛发生甲基化，并且相应基因的表达受损。特别是当肿瘤抑制基因的调控区CpG岛发生甲基化时，这些基因的表达和功能被阻断(像编码序列突变)，从而促进癌症的发生和发展，所述肿瘤抑制基因调控细胞周期或细胞凋亡、修复DNA、参与细胞粘附和细胞间相互作用、并抑制侵袭和转移。由于老化，CpG岛上也可能出现部分甲基化。
[0006]肿瘤相关基因的调控区甲基化是癌症的重要指示物，因此可以按多种方式使用，如癌症的诊断和早期诊断、癌症风险的预测、癌症预后的预测、治疗后的随访、对抗癌疗法的反应预测等。实际上，最近已经积极尝试研究血液、痰、唾液、粪便、尿液等中的肿瘤相关基因的启动子甲基化，并将其结果用于治疗各种类型的癌症(Ahlquist,D.A.等人,Gastroenterol.,119:1219,2000)。
[0007]在这种技术背景下，本申请的诸位专利技术人确定可以使用特异性扩增多个甲基化结直肠癌标记基因的引物以高检测限和准确性检测结直肠癌标记基因的甲基化，从而完成本专利技术。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的是提供一种提供关于使用特异性扩增多个甲基化结直肠癌标记基因的引物诊断结直肠癌的信息的方法。
[0009]本专利技术的另一个目的是提供一种使用特异性扩增多个甲基化结直肠癌标记基因的引物诊断结直肠癌的组合物。
[0010]本专利技术的再另一个目的是提供一种包括所述组合物的用于诊断结直肠癌的试剂盒。
[0011]为了实现上述目的，本专利技术提供了一种提供关于诊断结直肠癌的信息的方法，所述方法包括(a)将样品用至少一种试剂处理，所述至少一种试剂不同地修饰甲基化SDC2(黏结蛋白聚糖2)和ADHFE1(含铁醇脱氢酶1)基因以及非甲基化SDC2和ADHFE1基因；以及(b)用特异性扩增所述甲基化SDC2和ADHFE1基因的引物进行处理。
[0012]此外，本专利技术提供了一种用于诊断结直肠癌的组合物，所述组合物包括不同地修饰甲基化SDC2(黏结蛋白聚糖2)和ADHFE1(含铁醇脱氢酶1)基因以及非甲基化SDC2和ADHFE1基因的至少一种试剂，以及特异性扩增所述甲基化SDC2和ADHFE1基因的引物。
[0013]此外，本专利技术提供了一种包括所述组合物的用于诊断结直肠癌的试剂盒。
附图说明
[0014]图1示出使用结直肠癌手术患者的癌组织及其相邻正常组织DNA进行基因组水平甲基化分析(MeDIA
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CpG微阵列)的结果；
[0015]图2示出使用甲基化特异性引物对ADHFE1基因扩增的结果；
[0016]图3示出使用甲基化特异性引物对ADHFE1基因扩增的结果；以及
[0017]图4示出在正常人和结直肠癌患者中，通过检测SDC2基因的甲基化和ADHFE1基因的甲基化诊断结直肠癌的结果。
具体实施方式
[0018]除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本专利技术所属领域的技术人员通常所理解的含义相同的含义。通常，本文所用的命名法是本领域熟知的，并且是典型的。
[0019]本申请的诸位专利技术人已经确定，与基于单个结直肠癌标记基因的甲基化检测的程度相比，使用特异性扩增多个甲基化结直肠癌标记基因的引物可以改善甲基化DNA检测的灵敏性和特异性。在根据本专利技术的具体实施方案中，与SDC2基因的甲基化检测相比，通过检测SDC2基因和ADHFE1基因的甲基化改善了结直肠癌诊断的灵敏性和特异性，由此在诊断结直肠癌方面的有用性很高。
[0020]因此，本专利技术的一个方面涉及一种提供关于诊断结直肠癌的信息的方法，所述方法包括(a)将样品用至少一种试剂处理，所述至少一种试剂不同地修饰甲基化SDC2(黏结蛋白聚糖2)和ADHFE1(含铁醇脱氢酶1)基因以及非甲基化SDC2和ADHFE1基因；以及(b)用特异性扩增所述甲基化SDC2和ADHFE1基因的引物进行处理。
[0021]在本专利技术中，步骤(a)是将所述样品用不同地修饰甲基化SDC2和ADHFE1基因和非甲基化SDC2和ADHFE1基因的至少一种试剂处理。
[0022]如本文所用，术语“甲基化”意指修饰成5
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甲基胞嘧啶(5
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mC)，其中甲基附接至胞嘧啶碱基环的第五个碳，并且5
‑
甲基胞嘧啶始终仅附接至CG二核苷酸的C(5'
‑
mCG
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3')，并且这种CG通常称为CpG。CpG的甲基化抑制了基因组中重复序列如Alu或转座子的表达，并且CpG是哺乳动物细胞中最常发生基因外变化的位点。该CpG的5
‑
mC通过脱氨作用自然转化为T，因此，在哺乳动物基因组中CpG仅以1％的频率存在，远低于其正常频率(1/4x1/4＝6.25％)。
[0023]存在称为CpG岛的区域，其中CpG非常密集。CpG岛长度为0.2
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3kb，并且是C本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种提供关于诊断结直肠癌的信息的方法，所述方法包括：(a)将样品用至少一种试剂处理，所述至少一种试剂不同地修饰甲基化SDC2(黏结蛋白聚糖2)和ADHFE1(含铁醇脱氢酶1)基因以及非甲基化SDC2和ADHFE1基因；以及(b)用特异性扩增所述甲基化SDC2和ADHFE1基因的引物进行处理。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述试剂是亚硫酸氢盐、酸式亚硫酸盐、二亚硫酸盐或其组合。3.根据权利要求1所述的方法，其中至少一个胞嘧啶碱基通过所述试剂的处理转化为尿嘧啶或不同于胞嘧啶的碱基。4.根据权利要求1所述的方法，其中特异性扩增所述甲基化ADHFE1基因的所述引物包含SEQ ID NO:1或4的序列。5.根据权利要求4所述的方法，其中特异性扩增所述甲基化ADHFE1基因的所述引物还包含SEQ ID NO:2或5的序列。6.根据权利要求1所述的方法，其中特异性扩增所述甲基化SDC2基因的所述引物包含SEQ ID NO:10或11的序列。7.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括(c)用探针进行处理，所述探针能够与使用步骤(b)中的引物特异性扩增的甲基化SDC2基因和甲基化ADHFE1基因各自互补杂交。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述能够与扩增的甲基化ADHFE1基因互补杂交的探针包含SEQ ID NO:3或6的序列。9.根据权利要求7所述的方法，其中所述能够与扩增的甲基化SDC2基因互补杂交的探针包含SEQ ID NO:12的序列。10.根据权利要求1所述的方法，其中使用选自以下的方法检测甲基化：PCR、甲基化特异性PCR、实时甲基化特异性PCR、使用甲基化DNA特异性结合蛋白的PCR、使用甲基化DNA特异性结合抗体的PCR、定量PCR、基因芯...

【专利技术属性】
技术研发人员：安城皖，吴泰祯，
申请(专利权)人：基因特力株式会社，
类型：发明
国别省市：