基因分型的方法技术

本发明专利技术涉及基因分型的方法，特别涉及被分配给各基因型的ID序列，以及使用所述ID序列的多重基因分型方法。当使用所述ID序列进行焦磷酸测序时，对于每个基因型可以得到独特、简单的热裂解谱图。因此，使用所述的ID序列，使得通过简单而有效的方式对病毒基因、疾病基因、细菌基因进行基因分型及基因鉴定，成为可能。此外，本发明专利技术的基因分型引物，可用于在不同的使用分配顺序和测序方法进行的基因分型方法中。

【技术实现步骤摘要】
基因分型的方法本申请是中国专利申请201080061597.0的分案申请。
本专利技术涉及基因分型的方法，特别涉及被分配给各基因型的ID序列，以及使用所述ID序列的多重基因分型方法。
技术介绍
已开发的检测感染性生物体的方法包括传统的通过培养来鉴别病原体的物理和化学特征的方法，以及检测病原体的特定遗传特征的方法。遗传特征的检测方法包括限制性片段长度多态性(RFLP)分析、扩增片段长度多态性(AFLP)分析、脉冲场凝胶电泳、任意引物聚合酶链反应(AP-PCR)技术，基于重复序列的PCR，核糖分型和比较核酸测序。这些方法用于大多数诊断设置通常显得过于缓慢、昂贵、不可重复，并且技术要求高。所有上述方法一般都需要：使用繁琐的凝胶电泳步骤、病原体在培养过程中的生长、其基因组的DNA纯化，以及样本不包含多于一种类型的生物体。这些限制也存在于最近开发的采用高密度微阵列的检测方法(Salazaretal.,NucleicAcidsRes.24:5056-5057,1996；Troeschetal.,J.Clin.Microbiol.37:49-55,1999；Lashkarietal.,Proc.Natil.Acad.Sci.U.S.A.94:13057-13062,1997)。与此同时，焦磷酸测序是一种基于“通过DNA合成测序”原则的DNA测序方法，它不同于传统的Sanger测序方法，而是依赖于检测核苷酸插入过程中释放的焦磷酸。在焦磷酸测序法中，在聚合过程中顺序地逐一添加四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTPs)。与通过酶促反应被聚合的dNTPs结合的PPi发出光，并且发出的光根据顺序地添加的dNTPs的反应顺序而显示出信号峰，峰显示出与反应的dNTPs的数目成比例的多或者少的模式，这样能够确定病原体的核苷酸序列。近年来，已经使用了对病原体特异序列的PCR产物进行焦磷酸测序，基于由此获得的热裂解谱图(pyrogram)对临床标本中的病原细菌或病毒进行检测的方法(Travasso,CMetal,J.Biosci.,33:73-80,2008；Gharizadeh,Betal.,MolecularandCellularProbes,20,230-238,2006；Hoffmann,Cetal.,NucleicAcidResearch,1-8,2007)。然而，在上述焦磷酸测序技术中，核苷酸测序是根据dNTPs的分配顺序来进行，并且在模版中的不处于分配顺序中的核苷酸不会参加反应，因此不会形成信号峰。然而，当在所述分配顺序中相同的核苷酸持续出现时，根据所发射出的光的强度而确定信号峰的高度。因此，当多种病原体存在于同一样品中，不同病原体核苷酸的信号峰将出现重叠，因此，这使通过解释热裂解谱图来鉴定病原体变得困难。特别是随着重复序列数目增加时，前面序列的信号峰变得相对较低。因此，在多种病原体感染的情况下，根据每种病原体的感染程度来检测信号峰变得困难。因此，本专利技术付出大量的努力，使得能通过利用焦磷酸测序进行基因分型获得的独特且简单的热裂解谱图来获得所感兴趣的基因型。结果，本专利技术专利技术者发现，当ID序列含有ID标记、标志物和终止标记，同时所述ID序列独立存在于需要进行分型的特异性序列之外时，将所述ID序列与该特异性序列接连并用于进行焦磷酸测序，将获得针对于每种基因型的独特且简单的热裂解谱图，从而完成本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种ID序列，所述ID序列可用于进行焦磷酸测序，以便能通过独特、简单的热裂解谱图确定感兴趣的基因型。本专利技术的另一个目的是提供使用所述ID序列的基因分型方法。本专利技术又另一个目的是提供使用所述ID序列对HPV基因分型的方法。本专利技术再另一目的是提供使用所述ID序列检测KRAS基因突变的方法。本专利技术又一目的是提供使用所述ID序列检测呼吸道病毒的方法。为了实现上述目的，本专利技术提供一种用于基因分型的ID序列，其由A(ID-S)n-E组成，其中ID是ID标记，是选自A、T、C和G的单核苷酸；S是标志物，其是与相邻的ID标记连接，且不同于相邻的ID标记的核苷酸；E是终止标记，其是不同于所述标志物的核苷酸，并且n是从1到32的自然数。本专利技术还提供一种用于基因分型的ID序列，由ID-S组成，其中ID是ID标记，是选自A、T、C和G的单核苷酸；并且S是标志物，其是与相邻的ID标记连接，且不同于相邻的ID标记的核苷酸。本专利技术也提供一种基因分型引物，包括与所述ID序列连接的用于基因分型的基因特异性序列。本专利技术也提供一种基因分型的方法，其包括使用所述基因分型引物。本专利技术也提供一种用于HPV基因分型的方法，该方法的步骤包括：(a)根据每种HPV病毒的基因型设计用于基因分型的ID序列，该ID序列由(ID-S)n-E组成，其中ID是ID标记，是选自A、T、C和G的单核苷酸；S是标志物，其是与相邻的ID标记连接，且不同于相邻的ID标记的核苷酸；E是终止标记，其是不同于所述标志物的核苷酸，并且n是从1到32的自然数；(b)构建基因分型引物，所述基因分型引物由焦磷酸测序引物序列、ID序列和对应于该ID序列的对病毒基因型特异的序列组成；(c)使用该基因分型引物，通过PCR扩增含有HPV病毒的样品；以及(d)以扩增的PCR产物进行焦磷酸测序来获得一序列用作ID序列，并根据该ID序列区分HPV的基因型。本专利技术也提供一种用于检测KRAS基因突变的方法，该方法的步骤包括：(a)根据各KRAS基因突变来设计用于基因分型的ID序列，该ID序列由(ID-S)n-E组成，其中ID是ID标记，是选自A、T、C和G的单核苷酸；S是标志物，其是与相邻的ID标记连接，且不同于相邻的ID标记的核苷酸；E是终止标记，其是不同于所述标志物的核苷酸，并且n是从1到32的自然数；(b)构建检测引物，该检测引物由焦磷酸测序引物序列、ID序列和对应于该ID序列的对KRAS基因突变特异的序列组成；(c)使用该检测引物，通过PCR扩增含有KRAS基因的样品；以及(d)以扩增的PCR产物进行焦磷酸测序来获得ID序列的热裂解谱图，并根据该ID序列检测KRAS基因突变。本专利技术也提供了一种用于检测呼吸道病毒的方法，该方法的步骤包括：(a)根据流行性感冒A病毒、流行性感冒B病毒、RSV(呼吸道合胞病毒)B、鼻病毒和冠状病毒OC43的基因型各设计用于基因分型的ID序列，该ID序列由(ID-S)n-E组成，其中ID是ID标记，是选自A、T、C和G的单核苷酸；S是标志物，其是与相邻的ID标记连接，且不同于相邻的ID标记的核苷酸；E是终止标记，其是不同于所述标志物的核苷酸，并且n是从1到32的自然数；(b)构建检测引物，该检测引物由焦磷酸测序引物序列、ID序列和对应于该ID序列的对呼吸道病毒基因特异的序列组成；(c)使用检测引物，通过PCR扩增含有呼吸道病毒的样品，该呼吸道病毒选自由流行性感冒A病毒、流行性感冒B病毒、呼吸道合胞病毒B、鼻病毒和冠状病毒OC43的组成的组；以及(d)以扩增的PCR产物进行焦磷酸测序来获得ID序列的热裂解谱图，并根据该ID序列检测呼吸道病毒。本专利技术也提供ID序列在制备用于体外对多个目的基因进行基因分型的引物中的应用，包括：i)构建引物，其中所述引物包括与被分配给各基因型的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种对样品中的不同目的基因进行基因分型的方法，包括：i)构建基因分型引物，其中所述引物包括与被分配给各基因型的ID序列相连的基因特异性序列，其中每个ID序列由ID标记、N个标志物和终止标记组成，其中ID标记选自A、T、C和G的核苷酸，N个标志物是以相同顺序排列并与相邻的ID标记不同的核苷酸，终止标记是在最后面的标志物之后并与最后面的标志物不同的核苷酸；其中N是2‑32的自然数，以及其中ID标记可以位于标志物前面并且是由与位于其后的标志物不同的核苷酸组成的三种不同核苷酸之一，或者ID标记可以位于两个标志物之间并且是由与位于其两侧的标志物不同的核苷酸组成的三种不同核苷酸之一；ii)使用i)的基因分型引物，通过PCR扩增目的基因的模板，由此获得PCR产物；iii)根据步骤i)设计的ID序列的顺序分配dNTP，对步骤ii)的PCR产物测序，所述ID序列的顺序不包括用于终止标记的dNTP；和iv)根据ID标记的核苷酸和位置进行基因分型。

【技术特征摘要】
2009.11.16 KR 10-2009-01103311.ID序列在制备用于体外对多个目的基因进行基因分型的引物中的应用，其中所述ID序列由(ID-S)n-E组成，其中ID是ID标记，是选自A、T、C和G的单核苷酸；S是标志物，其是与相邻的ID标记连接，且不同于相邻的ID标记的核苷酸；E是终止标记，其是不同于所述标志物的核苷酸，并且n是从1到32的自然数，其中所述引物包括与被分配给各基因型的ID序列相连的基因特异性序列，所述体外对多个目的基因进行基因分型包括：i)构建引物；ii)使用i)的基因分型引物，通过PCR扩增目的基因的模板，由此获得PCR产物；iii)将经扩增的...

【专利技术属性】
技术研发人员：安城皖，吴命锡，
申请(专利权)人：基因特力株式会社，
类型：发明
国别省市：韩国;KR