丙型肝炎病毒基因分型的试剂盒及方法技术

本发明专利技术涉及一种疾病病原体基因检测技术，尤其涉及一种丙型肝炎病毒基因分型的试剂盒及方法，可用于检测国内发生的丙型肝炎病毒的型别1a，1b，2a，2b，3a，6a感染的辅助诊断。本发明专利技术采用尼龙膜载体，针对HCV不同基因型设计寡核苷酸探针，制备成基因芯片，再配以PCR引物以及其他组分，可以快速准确对血液样品中丙型肝炎病毒进行分型。本发明专利技术的丙型肝炎病毒基因分型的基因芯片和试剂盒及方法具有快速、灵敏、准确、高通量的特点，一次杂交反应可以检测多种靶序列，取材方便，无需特殊设备，仪器投入低，具有快速简便、敏感度高和特异性强的特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及ー种疾病病原体基因检测技木，尤其涉及一种，用于检测国内发生的丙型肝炎病毒的型别la，lb, 2a，2b，3a，6a感染的辅助诊断。
技术介绍
丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV),丙型肝炎呈世界性分布,人群普遍易感，是严重危害人类健康、流行范围广泛的传染病。其 病原体为丙型肝炎病毒(hepatitis Cvirus，HCV)。目前，其感染率为0. 1%-10%，平均为3%。全球有超过I. 7亿人感染HCV，其中每年有超过10万例HCV患者发展为肝癌，进而出现消化道出血及腹水。根据WH02002年年报，在2001年，慢性肝病引起1400万例死亡，包括79. 6万例由肝硬化引起、61. 6万例由原发性肝癌引起。HCV是正性单链RNA黄病毒，包括9400左右个核苷酸。HCV基因组具有一个单独的开放阅读框，基因结构由5’ -NCR-C-EI-E2-NSI-NS2-NS3-NS4-NS5-N-CR-3’组成，编码ー具有3010个氨基酸的多聚蛋白体，翻译后被分为病毒复制和病毒粒形成所必须的结构和非结构蛋白。HCV具有高度的变异性(其变异率高达I. 4-1. 9 X 10-3/核苷酸/年)和本身具有负选择作用的特征，高突变是由于复制酶无校正功能；易误性RDRP(error-prone RDRP,EP-RDRP)的存在以及正选择作用等原因。而其本身具有负选择作用又表现为病毒基因组中各种基因结构及功能不同，有些区域高度保守。根据全世界不同地区分离的HCV不同株的全部或部分基因组的系统进化分析，HCV分为6种主要的基因型(以1-6表示)，各型又分亚型(以a、b、c等表示)。HCV亚型已经超过100个，其中最常见的是la，lb，2a，2b，3a，6a，各型核酸序列之间相差31 — 34%，氨基酸序列相差大约30%，而亚型序列之间相差约20 — 23%。有几种HCV病毒株主要从东南亚被分离出，被命名为HCV7，8，9，10，11型，除了HCVlOa型(目前被列入HCV3型)，由于其系统进化上的相似性，其余各型被列入HCV6型。研究表明，HCV不同型别之间对干扰素治疗的敏感度不一，特别是I型较其它型别敏感度尤为差。不同型别HCV感染性肝炎，其急性、慢性的中度及重度、肝炎后肝硬化及原发性肝癌发生率都有不同，HCV基因型与丙型肝炎患者临床病情及其严重程度密切相关。鉴于不同HCV基因型感染者的临床表现、肝病严重程度及慢性化病程进展均有差异，抗病毒治疗的效果也不同。因此检测HCV基因型有助于判断治疗的难易程度、制定个体化抗病毒治疗方案。目前对HCV基因分型方法主要有限制性长度多态性分析法(RFLP)，基因型特异性引物PCR法，基因型特异性探针核酸杂交分析法，直接测序法等方法，但是这些方法大多存在操作繁琐，对设备要求高，检测时间长，通量低，还存在灵敏度低，特异性不高等缺点。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的缺陷和不足，制造具有高通量、高准确性的丙型肝炎病毒基因分型的基因芯片和试剂盒及方法，可以一次性对多个样本中HCV进行准确分型检测，节省检测时间。本专利技术技术方案为提供一种丙型肝炎病毒基因分型的试剂盒，主要包括PCR反应液和DNA杂交膜条，所述DNA杂交膜条包括尼龙膜，所述尼龙膜上固定有探针，所述探针为可分别与丙型肝炎病毒各种亚型病毒的核酸杂交的核苷酸，所述探针序列如下所示针对HBVla 型设计探针 Yl :5’ -AAITGCCAGGACGACCGG-3’ ；针对HBVlb 型设计探针 Y2 :5’ -AAITGCCAGGATGACCGGG-3’ ；针对HBVlb 型设计探针 Y3 :5’ -CCCGGAAITGCCAGGAC-3’ ； 针对HBV2a 型设计探针 Y4 :5 ’ -CAATGCCTGGAGATTTGGGCG-3 ’ ；针对HBV2a 型设计探针 Y5 :5 ’ -CAATGCCTGGAGATTTGGGC-3 ’ ；针对HBV2b 型设计探针 Y6 :5’ -CTCAATGCCTGGAGAITTGG-3’ ；针对HBV2b 型设计探针 Y7 :5’ -GCTCAATGCCTGGAGAITTGG-3’ ；针对HBV3a 型设计探针 Y8 :5 ’ -CAATGCCTGGAGATTTGGG-3 ’ ；针对HBV3a 型设计探针 Y9 :5 ’ -CGAGGTAGACGTCAGCC-3 ’ ；针对HBV3a 型设计探针 YlO :5’ -ACCTCGAGGTAGACGTCAGCC-3’ ；针对HBV6a 型设计探针 Yl I :5’ -AACCTCGAGGTAGACGTCAGCC-3’ ；针对HBV6a 型设计探针 Y12 :5’ -GCAACCTCGAGGTAGACGT-3’ ；针对HBV6a 型设计探针 Y13 :5’ -TAGACGTCAGCCTATCCCCAA-3’ ；针对HBV1-6型设计通用探针(即阳性探针HP)Y14:5’ -TAGACGCCAGCCTATTCCCA-3’ ；阴性探针HN: 5 ’ -GGTCCTGTTTAACTGGCG-3 ’ ；所述各探针5’端进行氨基标记以与尼龙膜偶联。优选的，上述丙型肝炎病毒基因分型的试剂盒中，所述尼龙膜上还设置有显色控制探针CC，所述显色控制探针CC序列如下所示5’-GCGCAGGGCCACAATAATGG-3’，所述cc探针5’端进行氨基标记，3’端进行生物素标记。优选的，上述丙型肝炎病毒基因分型的试剂盒中，所述PCR反应液包括扩增丙型肝炎病毒各种亚型病毒的核酸的引物，所述引物序列如下所示逆转录引物RT :5’ -CGTCTAGCCATGGCGTTAGT-3’ ；上游引物F : 5 ’ -GAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGT-3，；下游引物R : 5，-CGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3，。所述上游引物F的5 ’端进行生物素标记。优选的，上述丙型肝炎病毒基因分型的试剂盒中，所述PCR反应液还包括内參系统，所述内參照系统为拟南芥内參照系统，包括内參引物Fl :5’-TCATCGTCGCTGGAGCTGGIT-3，;内參引物Rl :5，-CGGCGGTTTGTCAAGCTGAT-3，；内參探针PC :5’ -TGCCGATATAGGTCACAGCATGGGC-3’ ；所述内參引物Fl的5’端进行生物素标记。优选的，上述丙型肝炎病毒基因分型的试剂盒中，所述探针浓度为5-20 u M0本专利技术的另ー技术方案为提供一种丙型肝炎病毒基因分型的方法，该方法包括下述具体步骤a、设计分型引物与探针，所述探针如权利要求I探针Y1-Y14所示，所述引物包括逆转录引物 RT :5’ -CGTCTAGCCATGGCGTTAGT-3’ ；上游引物F : 5，-GAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGT-3，；下游引物R : 5，-CGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3，；b、用活性氨基标记步骤a所述探针的5’端，并将其依次固定在尼龙膜上，制成检测膜条，对所述下游引物R的5’端进行生物素标记；C、利用步骤a中所述引物进行HBV DNA 扩增，将扩增产物与检测膜条杂交，以过氧化物酶与四甲基联苯胺显色本文档来自技高网...

【技术保护点】
丙型肝炎病毒基因分型的试剂盒，主要包括PCR反应液和DNA杂交膜条，其特征在于，所述DNA杂交膜条包括尼龙膜，所述尼龙膜上固定有探针，所述探针为可分别与丙型肝炎病毒各种亚型病毒的核酸杂交的核苷酸，所述探针序列如下所示：针对HBV1a型设计探针Y1：5’？AATTGCCAGGACGACCGG？3’；针对HBV1b型设计探针Y2：5’？AATTGCCAGGATGACCGGG？3’；针对HBV1b型设计探针Y3：5’？CCCGGAATTGCCAGGAC？3’；针对HBV2a型设计探针Y4：5’？CAATGCCTGGAGATTTGGGCG？3’；针对HBV2a型设计探针Y5：5’？CAATGCCTGGAGATTTGGGC？3’；针对HBV2b型设计探针Y6：5’？CTCAATGCCTGGAGATTTGG？3’；针对HBV2b型设计探针Y7：5’？GCTCAATGCCTGGAGATTTGG？3’；针对HBV3a型设计探针Y8：5’？CAATGCCTGGAGATTTGGG？3’；针对HBV3a型设计探针Y9：5’？CGAGGTAGACGTCAGCC？3’；针对HBV3a型设计探针Y10：5’？ACCTCGAGGTAGACGTCAGCC？3’；针对HBV6a型设计探针Y11：5’？AACCTCGAGGTAGACGTCAGCC？3’；针对HBV6a型设计探针Y12：5’？GCAACCTCGAGGTAGACGT？3’；针对HBV6a型设计探针Y13：5’？TAGACGTCAGCCTATCCCCAA？3’；针对HBV1？6型设计通用探针（即阳性探针HP）Y14：5’？TAGACGCCAGCCTATTCCCA？3’；阴性探针HN:5’？GGTCCTGTTTAACTGGCG？3’；所述各探针5’端进行氨基标记以与尼龙膜偶联。...

【技术特征摘要】
1.丙型肝炎病毒基因分型的试剂盒，主要包括PCR反应液和DNA杂交膜条，其特征在于，所述DNA杂交膜条包括尼龙膜，所述尼龙膜上固定有探针，所述探针为可分别与丙型肝炎病毒各种亚型病毒的核酸杂交的核苷酸，所述探针序列如下所示 针对 HBVla 型设计探针 Yl :5’ -AATTGCCAGGACGACCGG-3’ ； 针对 HBVlb 型设计探针 Y2 :5’ -AATTGCCAGGATGACCGGG-3’ ； 针对 HBVlb 型设计探针 Y3 :5’ -CCCGGAATTGCCAGGAC-3’ ； 针对 HBV2a 型设计探针 Y4 :5’ -CAATGCCTGGAGAITTGGGCG-3’ ； 针对 HBV2a 型设计探针 Y5 :5’ -CAATGCCTGGAGATTTGGGC-3’ ； 针对 HBV2b 型设计探针 Y6 :5’ -CTCAATGCCTGGAGATTTGG-3’ ； 针对 HBV2b 型设计探针 Y7 :5’ -GCTCAATGCCTGGAGATTTGG-3’ ； 针对 HBV3a 型设计探针 Y8 :5’ -CAATGCCTGGAGAITTGGG-3’ ； 针对 HBV3a 型设计探针 Y9 :5’ -CGAGGTAGACGTCAGCC-3’ ； 针对 HBV3a 型设计探针 YlO :5’ -ACCTCGAGGTAGACGTCAGCC-3’ ； 针对 HBV6a 型设计探针 Yll :5’ -AACCTCGAGGTAGACGTCAGCC-3’ ； 针对 HBV6a 型设计探针 Y12 :5’ -GCAACCTCGAGGTAGACGT-3’ ； 针对 HBV6a 型设计探针 Y13 :5’ -TAGACGTCAGCCTATCCCCAA-3’ ； 针对HBV1-6型设计通用探针(即阳性探针HP) Y14 :5’ -TAGACGCCAGCCTATTCCCA-3’ ； 阴性探针 HN: 5’ -GGTCCTGTTTAACTGGCG-3’ ； 所述各探针5’端进行氨基标记以与尼龙膜偶联。2.如权利要求I所述的丙型肝炎病毒基因分型的试剂盒，其特征在于，所述尼龙膜上还设置有显色控制探针CC，所述显色控制探针CC序列如下所示5’ -GCGCAGGGCCACAATAATGG-3’，所述显色控制探针CC的5’端进行氨基标记，3’端进行生物素标记。3.如权利要求I所述的丙型肝炎病毒基因分型的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括扩增丙型肝炎病毒各种亚型病毒的核酸的引物，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭春梅，胡守旺，谢佐福，周晓强，姚铭锋，
申请(专利权)人：福州泰普生物科学有限公司，
类型：发明
国别省市：